电泳仪器操作课实用版课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,电泳原理,电泳的定义：,带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动的现象。,电泳的基本原理：,不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的,。,电泳技术：,利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。,电泳的作用：,主要用于蛋白质、核酸、同工酶、氨基酸、多肽等物质的分离；还可用于对分离物质的纯度和分子量的测定。,电泳原理电泳的定义：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反,1,电泳的分类,根据电泳分子的大小分为：,凝胶电泳：主要用于小蛋白质分子和核酸分子的分离,毛细管电泳：主要用于糖类和大蛋白分子的分离,根据电泳方法，大致可分为,3,类：,显微电泳,自由界面电泳,区带电泳：应用最广泛,电泳的分类根据电泳分子的大小分为：,2,电泳的分类,区带电泳按支持物的物理性状不同，可分为：,(1,）纸电泳：支持物为滤纸,;,(2,）粉末电泳：如纤维素粉，淀粉，玻璃粉电泳；,(3,）凝胶电泳：如琼脂，琼脂糖，硅胶，淀粉胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳；,(4,）缘线电泳：如尼龙丝，人造丝电泳,区带按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：,(1,）水平板电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式；,(2,）垂直板电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。,(3,）柱状（管状）电泳：聚丙烯酰胺凝胶可灌入适当的电泳管中做成管状电泳。,电泳的分类区带电泳按支持物的物理性状不同，可分为：,3,电泳的分类,根据蛋白质分离的目的分为：,单向电泳：只在聚丙烯酰胺凝胶上分离。适于分离种类较少的蛋白。,双向电泳：第一向使用预制胶条进行蛋白质的等电聚焦分离，第二向将胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋白质的分子量大小与第一向相垂直分离。用于蛋白质的分离，可将提取的蛋白质混合物中数千种蛋白质同时分离开。,电泳的分类根据蛋白质分离的目的分为：,4,单向与双向电泳条带比较,单向电泳条带,双向电泳条带,单向与双向电泳条带比较单向电泳条带双向电泳条带,5,电泳实验过程,水平板电泳：,制胶,插试样格（梳子）,取试样格,点样,电泳,染色,凝胶成像（对电泳结果进行观察记录和分析）。,垂直板电泳：,连续电泳：直接灌分离胶,配制凝胶溶液,灌胶,不连续电泳：灌分离胶,浓缩胶,插试样格,取试样格,点样,电泳,染色,脱色,成像观察和记录。,电泳实验过程水平板电泳：,6,仪器一、电泳仪,作用：在电泳中提供电压与电流。,1,、电泳仪的分类,根据电泳仪的电压范围可将电泳仪分为,3,类,：,（,1,）常压电泳仪（,600V,）：用于净电荷和,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳；,（,2,）高压电泳仪（,3000V,）：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和,DNA,测序；,（,3,）超高压电泳仪（,3000,5000V,）：用于毛细管电泳。,根据控制程序分为：,单恒（恒压）、双恒（恒流和恒压）、三恒（恒流、恒压、恒功率）。,(,不论是单恒、双恒、还是三恒，仪器工作时任何情况下只能稳,U,、,I,、,P,中的一种参数,),。,仪器一、电泳仪作用：在电泳中提供电压与电流。,7,毛细管电泳仪,超高压电泳仪,（高效毛细管电泳仪,),常压电泳仪,高压电泳仪,毛细管电泳仪超高压电泳仪常压电泳仪高压电泳仪,8,梯度电泳仪,(,用于土壤微生物的分离）,梯度电泳仪(用于土壤微生物的分离）,9,生物分析仪（微流控芯片电泳仪）,生物分析仪（微流控芯片电泳仪）,10,2,、操作方法,这里以我们实验室常用的北京六一仪器厂生产的,DYY-12,型电脑三恒多用电泳仪为例说明。,U,、,I,、,P,的有效输入范围：,U,：,4-1000v,（常压电泳仪）,I,：,4-500mA,P,：,4-300w,可以同时连接,4,组电泳槽（并联），,此时应选择稳压输出,，当接多个电泳槽时，则仪器显示的电流数值为各槽电流之和。,电极插座,2、操作方法电极插座,11,（1）,设置工作程序,方法有三种：,用键盘输入新的工作程序，主要使用该方法（见后边介绍）。,按,读取,键，取出保存在0中的上次工作程序，然后按确认键。,（该电泳仪默认保存上次程序）,按,读取、,0-9、确定,键，取出保存在(0-9)中的工作程序。取出保存的程序，必须检查一遍，确认无误后才可启动仪器工作。,（1） 设置工作程序,12,（,2,）按键操作,A,、,模式,键用于选择设置工作模式。,每按一下模式键，其工作方式按下列顺序改变：,STD,（标准）,TIME(,定时,) VH(,伏时,) STEP(,分步,),标准模式,到时不关输出，只是蜂鸣提示，需人工关机；,定时模式,到时关输出；,伏时模式,输出电压与工作时间的乘积达到设定值时关输出；,分步模式,输出按步（,-,）及模式（定时或伏时）分别设定及执行。,通常使用标准模式和定时模式。,B,、,选择,键用于选择设置,U,、,I,、,P,、,T,的参数,设置时先看,U,是否为反显状态，每按一次移到下一个参数，移动顺序为：,U= I= P= T=,（2）按键操作,13,C,、,清除,键：可以清除有反显提示的参数数值。如果输入错误，可以按,清除,键，再重新输入。,D,、,启动,键：确认参数无误后，启动电泳仪输出程序。,E,、,+,键：在输出情况下递增反显,U,、,I,、,P,、,T,的数值；每按一次递增一个数字，弱按住不放，则连续快速递增。,F,、,-,键：在输出情况下递减反显,U,、,I,、,P,、,T,的数值；每按一次递减一个数字，弱按住不放，则连续快速递减。,G,、,继续,键：当电泳过程中出现人为中断停机，并希望继续接着输出工作，可以按,继续,键，此后电泳仪接着前面的工作时间继续工作。,工作结束时，仪器显示“,End”,，并连续蜂鸣提示，此时可按任意键止闹。关掉电源，拔出电源连接线。,C、清除键：可以清除有反显提示的参数数值。如果输入错误，,14,（,3,）电源参数设定原则,稳定电压时，首先将电压的准确数值输入进去，其它电流或功率值要高于正常工作值，否则电压不能稳恒定。稳定电流时，首先将电流的准确数值输入进去，其它电压或功率值要高于正常工作值，否则电流不能恒定。稳定功率时，首先将准确的数字输进去，其它电压电流值要高于正常工作值，否则功率不能恒定。,一般预置电压或电流值要在工作电压或电流值的基础上加,30,，通常,1v,电压,0.35mA,工作电流，,1mA3.5V,工作电压，实际工作功率工作电压,工作电流。,例如：恒定电压为,200v,，预设电流,100mA,（工作电流,+30mA,），通常,V,电压,0.35mA,工作电流，,200V,电压预计工作电流为,70mA,，电流再向上加,30mA=100mA,。,（3）电源参数设定原则 稳定电压时，首先将电压的准确数值输入,15,显示屏,V,：,0 v u=100v Mode: STD,I,：,0 mA I=50mA ,W,：,0 w p=50w ,T: 00:00 T=1:00 ,实际工作值,设置参数,显示屏V： 0 v u=100v M,16,（3）合上制胶槽面板，用四个转向夹子夹紧固定。,4、电极缓冲液的配制。,P：4-300w,（5）从左侧选择光源，紫外成像用紫外透射仪(transluminator)，白光成像使用上部光源(upper)或底部光源(lower)。,每按一次递增一个数字，弱按住不放，则连续快速递增。,根据电泳方法，大致可分为3类：,毛细管电泳：主要用于糖类和大蛋白分子的分离,（5）未聚合的丙烯酰胺是神经毒剂。,4、电泳槽的清洗与维护,根据电泳仪的电压范围可将电泳仪分为3类：,制胶浓度必须根据marker要求的浓度制备，否则小分子物质很容易跑出胶块。,（8）点击菜单栏“文件”（file），选择“输出图像”（export image），选择图像类型为bmp或jpg文件格式，输入文件名，点击存储（save）。,将划开的玻璃反转,将胶面朝着染色液,用薄刀片轻轻在胶面顶部划开一个小口子,用一次性吸管顺着划开的小口不断滴加染色液,胶自动从玻璃板剥离下来,落进染色液中, 染色1小时。,电泳技术：利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。,制胶浓度必须根据marker要求的浓度制备，否则小分子物质很容易跑出胶块。,将凝胶移至染色区的通风橱内用EB染色液染色1020分钟，然后将胶片转移至冲洗盘，冲洗掉多余的EB染色液，再转移到海绵上，进行两次彻底的吸水，直至胶片上没有水痕时，用保鲜膜包裹胶片，转移至凝胶成像仪中进行凝胶成像。,使用后要彻底清洗，可用海绵沾少许洗衣粉、洗涤剂清洗，再用无离子水冲洗干净，放在无灰尘处晾干备用。,根据蛋白质分离的目的分为：,（1）清洗配件及硅化玻璃,还可用于对分离物质的纯度和分子量的测定。,3,、电泳仪使用注意事项,严禁将电泳槽放在电泳仪顶部，避免缓冲液洒进仪器内部。,电泳前，禁止将电泳槽附带的电源导线连接到电泳仪电源上。,勿用有机溶剂清洁面板。,本仪器工作时电压较高，使用中应避免接触输出回路及电泳槽内部，以免发生危险。,（3）合上制胶槽面板，用四个转向夹子夹紧固定。3、电泳仪使用,17,仪器二、电泳槽,常用电泳槽分为,水平板和垂直板两种。,1,、电泳槽的作用,水平板电泳槽主要用于大分子量的核酸和蛋白质的鉴定、分离和制备，还可测定核酸的分子量。,垂直板电泳槽主要用于小分子量的核酸和蛋白质分离、纯化及检测；还可进行双向电泳的第二向。,这里我们以常用的水平板电泳槽为例讲解使用方法。,仪器二、电泳槽常用电泳槽分为水平板和垂直板两种。,18,水平电泳槽,电泳槽种类,水平电泳槽电泳槽种类,19,垂直电泳槽,电泳槽种类,垂直电泳槽电泳槽种类,20,电泳槽种类,柱状电泳槽,电泳槽种类柱状电泳槽,21,2,、水平板电泳槽,主要结构,主要由装有铂丝电极和缓冲液的主槽、凝胶托盘、试样格（梳子）、挡板与电泳导线组成。,3,、水平板电泳槽（,DYCP-33A,型）使用方法,先把凝胶托盘放在平台上，把挡板插入槽中。将融化的琼脂糖溶液冷至,55 ,，用少量琼脂糖凝胶将玻璃板封边，放置样品梳。接着将融化的琼脂糖凝胶溶液不间断地倒在模子中（厚度依样品浓度而定，须注意避免气泡混入）,室温下自然凝固。,2、水平板电泳槽主要结构,22,待凝胶聚合后，轻轻拔掉挡板和梳子。注意先拔一侧，垂直拔出会使胶孔产生真空，导致部分凝胶被带出。把凝胶托盘移入电泳槽，加入缓冲液，使凝胶全部被浸没。（注意：加样孔靠近负极一端）,在梳井内加样，注意避免引入气泡；枪头不能插入太深，防止穿透胶块。,盖好上盖，连接电泳仪电源与电泳槽之间的电泳导线。,注意不要接错正负极，检查无误后接通电泳仪电源。根据凝胶板的薄厚选择适宜的电压与电流。,待凝胶聚合后，轻轻拔掉挡板和梳子。注意先拔一侧，垂直拔出会,23,当溴酚蓝指示剂前沿到达胶的底部,3/4,处时停止电泳。电泳实验结束先关闭电泳仪电源；随之拔除电泳导线，然后打开泳槽上盖，取出凝胶托盘。,将凝胶移至染色区的通风橱内用,EB,染色液染色,10,20,分钟，然后将胶片转移至冲洗盘，冲洗掉多余的,EB,染色液，再转移到海绵上，进行两次彻底的吸水，直至胶片上没有水痕时，用保鲜膜包裹胶片，转移至凝胶成像仪中进行凝胶成像。,当溴酚蓝指示剂前沿到达胶的底部3/4处时停止电泳。电泳实验,24,4,、水平板电泳中常见问题与注意事项,染色必须在电泳结束后，在染色区进行，禁止在电泳槽内加,EB,染色液。,分不清正负极，导致样品跑到缓冲液中。红色为正级、黑色为负极，样品从负极跑向正极，加样孔靠近负极一端。,加样时枪头不能插入太深，防止穿透胶块，刚刚插入即可。,制胶浓度必须根据,marker,要求的浓度制备，否则小分子物质很容易跑出胶块。,在没有经验的情况下，最好设置定时，否则由于疏忽样品就可能跑出胶外。,缓冲液问题。样品必须完全溶解于上样缓冲液中（,TE,），否则不能在凝胶中移动；制胶和实际电泳采用同种缓冲液（,TAE,）；缓冲液加到凝胶上之后才能点样。,4、水平板电泳中常见问题与注意事项,25,垂直电泳整个操作过程,制胶,灌胶（不连续电泳：灌分离胶,加蒸馏水,灌浓缩胶）,插入试样格,加缓冲液（上、下两部分）,拔掉试样格,加样品,盖上盖子，接通电泳仪电源,染色,脱色。,垂直电泳整个操作过程,26,U= I= P= T=,（2）高压电泳仪（3000V）：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；,9、向凝胶内插入相应的加样梳。,注意：边条应与玻璃底部及侧边对齐！,把凝胶托盘移入电泳槽，加入缓冲液，使凝胶全部被浸没。,（2）将接触胶面的二块玻璃板用纱布沾着酒精顺着一个方向擦，然后晾干,再将清洗干净的凝胶玻璃放入制胶架内的PE软片上, 凹槽玻璃冲外。,35mA工作电流，1mA3.,（11）2小时内不再使用时关闭电脑，关闭暗箱电源。,使用时注意保持电泳槽的清洁；,将平板玻璃平放于水平台上，将边条放于玻璃板两侧。,单恒（恒压）、双恒（恒流和恒压）、三恒（恒流、恒压、恒功率）。,（5）使用时，应掌握好时间，不要一次将时间设得太长，以免引起胶过热、热焦或起火。,区带按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：,（3）合上制胶槽面板，用四个转向夹子夹紧固定。,根据电泳仪的电压范围可将电泳仪分为3类：,（3）带盖的密封容器放入炉内加热时，请拧开盖子。,（4）灌分离胶后立即加蒸馏水覆盖；,标准模式到时不关输出，只是蜂鸣提示，需人工关机；,标准模式到时不关输出，只是蜂鸣提示，需人工关机；,根据控制程序分为：,JY-SCZ8,型垂直板电泳槽使用方法,U= I= P= T=JY,27,1,、使用去污剂将凝胶玻璃板反复擦洗晒干，再用无水乙醇擦净表面。,2,、制胶时，首先挑选适合凝胶厚度的电泳玻璃，采取凹形玻璃板（简称凹板）在内芯内侧、矩形玻璃板（简称平板）在内芯外侧的方向，顺着内芯一侧的紧固侧板小心放入。,特别注意,如果将凹板和平板的方向装反（平板在内，凹板在外），将无法直接电泳，需要再次移动玻璃。,3,、选择平整操作台面（建议在玻璃板上操作），当玻璃放入内芯后，确认凹、平板的底部边缘均与台面对齐，再拧紧紧固旋钮。,特别注意,使凹板、平板的底部边缘均与桌子上的玻璃台面对齐是密封的重要条件。如果是初学者，建议在拧紧紧固旋钮后将内芯翻转过来，便于用眼睛观察或者用手的触摸检查是否平齐。,1、使用去污剂将凝胶玻璃板反复擦洗晒干，再用无水乙醇擦净表面,28,4,、将装好玻璃板的内芯，安装在制胶底座上，压紧吊扣。,5,、将配制好的分离胶溶液，缓慢向凝胶腔内注入，注意不要产生气泡。,6,、分离胶灌完后，用滴管在分离胶表面轻轻注入一层正丁醇溶液或蒸馏水以保证分离胶的无氧聚合。,7,、当分离胶聚合后，倒出表面的正丁醇溶液或蒸馏水，并用吸纸吸干。,8,、在分离胶表面注入浓缩胶，注入高度距凹板下沿,2-3mm,或与之平齐。,9,、向凝胶内插入相应的加样梳。,特别注意在灌胶时无论是灌分离胶或是浓缩胶，在凝胶没有聚合时不要移动制胶器，以确保凝胶表面的平整，保证最终的电泳效果。,10,、当凝胶聚合后，取出梳子，打开搭钩，从制胶器中取出内芯，放入电泳槽底槽中，制胶过程结束。,4、将装好玻璃板的内芯，安装在制胶底座上，压紧吊扣。,29,注意事项,1,、组装玻璃板。,在组装玻璃板时，下部的两个螺栓不要拧得过紧，只要使玻璃板与铝板充分接触即可。,2,、分离胶浓度的选择。,低浓度胶对大分子量蛋白质分离效果好；高浓度胶对小分子量蛋白质分离效果好。,3,、,TEMED,的加入量。,TEMED,是促进聚丙烯酰胺聚合的加速剂。加速效果随试剂保存时间而变化。对于陈旧试剂，可适当多加。事实上，配制分离胶时每块胶板按,2,滴加入，效果也不错。,4,、电极缓冲液的配制。,电极缓冲液的用量大、占体积、配制麻烦。如果经常跑胶，可考虑配制,5X,浓度的浓缩液。方法如下：将,144g,甘氨酸和,30.2g Tris,溶于,1,升蒸馏水中。使用时稀释,5,倍。,5,、丙烯酰胺的毒性。,丙烯酰胺和甲叉夹双丙烯酰胺都是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用。但在聚合形成凝胶后毒性降低，在胶体没凝固时不要乱倒胶液，应待凝固后放入垃圾桶。操作时应戴橡胶或塑料手套，尽量避免接触皮肤，并注意实验后洗手。,6,、保养铝板。,每次使用完后应及时清理、擦拭，尤其是铝板的表面，为防止长时间污垢堆积不能与玻璃板充分接触，以降低恒温效果。,7,、本品为易碎品，,在搬运过程中应注意轻拿轻放。,注意事项,30,附,1,：,DYCZ-24F,型电泳槽,操作方法,（,1,）将一片,PE,软片（可重复多次使用）平放在制胶架内。,（,2,）将接触胶面的二块玻璃板用纱布沾着酒精顺着一个方向擦，然后晾干,再将清洗干净的凝胶玻璃放入制胶架内的,PE,软片上,凹槽玻璃冲外。,（,3,）合上制胶槽面板，用四个转向夹子夹紧固定。,附1： DYCZ-24F型电泳槽操作方法（1）将一片PE软,31,（,4,）灌分离胶至上沿约,2,3,厘米处。,（,5,）立即加蒸馏水压上，以隔氧和去气泡。室温垂直放置，,30,60,分钟后分离胶完全聚合，倾出分离胶上的覆盖层液体，用滤纸条吸干残留水分。,（,6,）灌浓缩胶。,（4）灌分离胶至上沿约23厘米处。,32,（,7,）立即插入试样格；待胶凝固后，松开转向夹子，取出玻璃胶室。,（,8,）装夹玻璃胶室：在本体两侧装入玻璃胶室，注意使两凹口相对。插入斜插板并夹紧,(,注意使斜插板的大平面与玻璃接触,),。若只跑一块胶，将一侧不跑胶的平凹玻璃互换。,（7）立即插入试样格；待胶凝固后，松开转向夹子，取出玻璃胶室,33,（,9,）先在上槽内加入缓冲液，然后再在下槽内加入缓冲液,最多可加至上槽黑色密封条处。拔掉试样格。,（,10,）加样品：用微量注射器小心加入，每加完一个样品应清洗加样注射器，最后在所有不用的样品槽中加上等体积的样品溶解液。,（,11,）电泳：盖上上盖，接通电泳仪电源，选择适宜的电泳参数进行电泳。,（,12,）结束电泳：待电泳的指示剂跑到槽的底部后,停止电泳。先关闭电泳仪电源，然后拔掉电源导线，松开斜插板，放掉上槽缓冲液，取出玻璃胶室，用很薄的刀片,轻轻的插进凹槽玻璃的顶部与另一块玻璃之间的缝隙,用薄刀片轻轻向上撬,将上层玻璃轻轻撬开。,（,13,）染色：将有胶板的玻璃板平放在桌上，用刀片从,2,侧沿着玻璃条划开。,(,或不划开,带着玻璃染色,脱色,),将划开的玻璃反转,将胶面朝着染色液,用薄刀片轻轻在胶面顶部划开一个小口子,用一次性吸管顺着划开的小口不断滴加染色液,胶自动从玻璃板剥离下来,落进染色液中,染色,1,小时。,（,14,）脱色：将染色后的胶片放到脱色液中脱色,可用脱色摇床脱色,直至胶片背景兰色成完全透明状,即可看到清晰的分离条带。,（9）先在上槽内加入缓冲液，然后再在下槽内加入缓冲液,最多可,34,附,2,： 测序电泳槽,（,1,）清洗配件及硅化玻璃,清洗：,戴手套，清洗所有配件，包括：玻璃板、边条、梳子。,硅化：,先用纱布沾酒精顺时针方向擦两块玻璃板内侧，晾干后，用面巾纸沾,亲水硅烷,顺时针擦拭“平板玻璃”，用,疏水硅烷,顺时针擦“凹板玻璃”，晾干备用。,附2： 测序电泳槽（1）清洗配件及硅化玻璃,35,（,2,）制胶过程,制胶过程需在水平台上进行。,首先用水平球调节水平台的水平，水平台的三个支脚螺旋可调整水平。,将平板玻璃平放于水平台上，将边条放于玻璃板两侧。,注意：边条应与玻璃底部及侧边对齐！,（2）制胶过程,36,区带电泳按支持物的物理性状不同，可分为：,6、分离胶灌完后，用滴管在分离胶表面轻轻注入一层正丁醇溶液或蒸馏水以保证分离胶的无氧聚合。,1、使用去污剂将凝胶玻璃板反复擦洗晒干，再用无水乙醇擦净表面。,制胶灌胶（不连续电泳：灌分离胶加蒸馏水灌浓缩胶）插入试样格加缓冲液（上、下两部分）拔掉试样格加样品盖上盖子，接通电泳仪电源染色脱色。,（5）从左侧选择光源，紫外成像用紫外透射仪(transluminator)，白光成像使用上部光源(upper)或底部光源(lower)。,（2）本机全部为非污染操作，染色后的胶片应置于保鲜膜内移入凝胶成像暗室内，严禁直接将胶片放在滤光片上。,STD（标准） TIME(定时) VH(伏时) STEP(分步),注意：如图所示：将梳子从凝胶板的一端插入，慢慢向下用力，防止破坏鲨鱼齿的尖端。,7、本品为易碎品，在搬运过程中应注意轻拿轻放。,因为眼睛对微波最敏感，以免受到不必要的伤害。,毛细管电泳：主要用于糖类和大蛋白分子的分离,适于分离种类较少的蛋白。,待凝胶聚合后，轻轻拔掉挡板和梳子。,G、继续键：当电泳过程中出现人为中断停机，并希望继续接着输出工作，可以按继续键，此后电泳仪接着前面的工作时间继续工作。,U= I= P= T=,取出保存的程序，必须检查一遍，确认无误后才可启动仪器工作。,根据电泳分子的大小分为：,否则，容器内的空气会因加热后体积膨胀而产生爆裂，严重时可能产生爆炸。,待凝胶聚合后，轻轻拔掉挡板和梳子。,（1）点样时样品向上漂，不下沉时，尤其在加尿素（变性剂）的情况下，要用蒸馏水严格冲洗点样孔的杂质（未聚合丙烯酰胺），直至点样孔清晰透亮才可点样。,（,3,）安装胶板,旋钮旋紧的力度以红色密封条刚刚变形为准，旋紧的力度要均匀，用力过大或过小都会影响电泳槽正常运行。,（,4),加缓冲液,在上、下缓冲液槽中加注电泳缓冲液，液面高度要高过凹形玻璃板凹口底边,5,至,10,毫米。,（,5,）预电泳,连接电泳仪，恒功率,70,80W,，预电泳,30,分钟。,区带电泳按支持物的物理性状不同，可分为：（3）安装胶板,37,（,6,）插入鲨鱼齿梳,预电泳完成后，用滴灌冲洗上样孔后，将鲨鱼齿梳的尖端小心插入凝胶板。插入的深度以齿尖进入凝胶,1mm,为宜。,注意：如图所示：将梳子从凝胶板的一端插入，慢慢向下用力，防止破坏鲨鱼齿的尖端。,（,7,）上样,预电泳完毕后，断开电源，从靠里的凹玻璃处加样，上样量为,6,8ul,。,（6）插入鲨鱼齿梳,38,垂直电泳中常见问题及注意事项,（,1,）点样时样品向上漂，不下沉时，尤其在加尿素（变性剂）的情况下，要用蒸馏水严格冲洗点样孔的杂质（未聚合丙烯酰胺），直至点样孔清晰透亮才可点样。,（,2,）染色时，为了防止乙酸挥发影响呼吸，注意将染色盘用盖子盖住。,（,3,）灌胶前严格清洗模具，以免凝胶板和玻璃板之间产生气泡或滑胶。电泳后取凝胶板时因玻璃板不干净，凝胶不易从玻璃板上取下，易断裂。,（,4,）灌分离胶后立即加蒸馏水覆盖；灌浓缩胶前，先用滤纸吸去覆盖水,再灌胶。,（,5,）未聚合的丙烯酰胺是神经毒剂。,但在聚合形成凝胶后毒性降低，在胶体没凝固时不要乱倒胶液，应待凝固后放入垃圾桶，操作时注意戴手套。,垂直电泳中常见问题及注意事项,39,4,、电泳槽的清洗与维护,使用时注意保持电泳槽的清洁；使用后要彻底清洗，可用海绵沾少许洗衣粉、洗涤剂清洗，再用无离子水冲洗干净，放在无灰尘处晾干备用。,4、电泳槽的清洗与维护,40,仪器三、凝胶成像系统,仪器三、凝胶成像系统,41,1,、,什么是凝胶成像系统？,凝胶成像系统是一个集观察，拍摄和分析凝胶于一体的凝胶分析系统。使用该系统可以对凝胶进行定量和定性分析。（电泳结果的定性和定量分析）,2,、用途,用于核酸、蛋白质电泳的观察、照像和实验结果的科学分析。,1、什么是凝胶成像系统？,42,3,、结构,由,CCD,检测器、暗箱、紫外透射台、紫外和白光光源、图像采集软件、图像分析软件组成。,3、结构,43,4,、凝胶成像系统分析样品的工作原理,凝胶成像系统可以对样品进行定量和定性的分析。,定性的原理,：由于样品在电泳凝胶或者其他载体上的迁移率不一样，将未知样品在图谱中的位置与标准品在图谱中的位置相比较，可以确定位置样品的成份和性质，做定性分析。,定量的原理,：光源发出的光照射到样品，不同的样品对光吸收的量有差异，从而照相所得的图像上面的样品条带的光密度也会有差异。光密度与样品的浓度或者质量成线性关系。将未知样品的光密度与已知浓度的样品条带的光密度进行比较，可以得到未知样品的浓度或者质量，做定量分析。,4、凝胶成像系统分析样品的工作原理,44,5,、操作方法,（,1,）打开紫外箱（暗箱）电源开关，该开关在暗 箱右后部。,（,2,）启动电脑，启动成像应用程序,Genesnap,。,（,3,）上拉暗箱门，紫外成像时在蓝色玻璃板上放入染色后的凝胶。,（,4,）关上暗箱门。,点击,点击应用程序,启动应用程,序后的屏幕,45,（,5,）从左侧选择光源，紫外成像用紫外透射仪,(transluminator),，白光成像使用上部光源,(upper),或底部光源,(lower),。,（,7,）再次点击成像。,点击成像,（5）从左侧选择光源，紫外成像用紫外透射仪(translum,46,不连续电泳：灌分离胶浓缩胶,STD（标准） TIME(定时) VH(伏时) STEP(分步),一般预置电压或电流值要在工作电压或电流值的基础上加30，通常1v电压0.,本仪器工作时电压较高，使用中应避免接触输出回路及电泳槽内部，以免发生危险。,样品必须完全溶解于上样缓冲液中（TE），否则不能在凝胶中移动；,（1）打开紫外箱（暗箱）电源开关，该开关在暗 箱右后部。,制胶插试样格（梳子）取试样格点样电泳染色凝胶成像（对电泳结果进行观察记录和分析）。,（14）脱色：将染色后的胶片放到脱色液中脱色, 可用脱色摇床脱色,直至胶片背景兰色成完全透明状, 即可看到清晰的分离条带。,注意不要接错正负极，检查无误后接通电泳仪电源。,（3）上拉暗箱门，紫外成像时在蓝色玻璃板上放入染色后的凝胶。,3、选择平整操作台面（建议在玻璃板上操作），当玻璃放入内芯后，确认凹、平板的底部边缘均与台面对齐，再拧紧紧固旋钮。,单向与双向电泳条带比较,单恒（恒压）、双恒（恒流和恒压）、三恒（恒流、恒压、恒功率）。,4、电泳槽的清洗与维护,因为眼睛对微波最敏感，以免受到不必要的伤害。,1、使用去污剂将凝胶玻璃板反复擦洗晒干，再用无水乙醇擦净表面。,(2）垂直板电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。,V： 0 v u=100v Mode: STD,标准模式到时不关输出，只是蜂鸣提示，需人工关机；,JY-SCZ8型垂直板电泳槽使用方法,（,6,）点击左侧上部显示图像，可按“,-”,、“,+”,依次调节光圈、图像缩放大小、调节焦距。,光圈,图像缩放,焦距,不连续电泳：灌分离胶浓缩胶（6）点击左侧上部显示图像，,47,电泳仪器操作课实用版课件,48,（,8,）点击菜单栏“文件”（,file,），选择“输出图像”（,export image,），选择图像类型为,bmp,或,jpg,文件格式，输入文件名，点击存储（,save,）。,（,9,）关闭退出应用程序。,（,10,）取出凝胶，,EB,污染胶放置于指定地点，普通胶放入垃圾箱。,（,11,）,2,小时内不再使用时关闭电脑，关闭暗箱电源。,（,12,）填写仪器使用记录、图片文件名称，未登记图片文件不予保留，登记图片文件保留期限为,60,天。,（8）点击菜单栏“文件”（file），选择“输出图像”（ex,49,（,13,）需要对电泳结果进行分析的，打开,Genetools,，按需要依次操作。,点击分析软件,（13）需要对电泳结果进行分析的，打开Genetools，按,50,6,、注意事项,（,1,）该仪器为大型贵重精密仪器，禁止移动仪器、禁止自行修改设置、禁止删除文件！,（,2,）本机全部为非污染操作，染色后的胶片应置于保鲜膜内移入凝胶成像暗室内，严禁直接将胶片放在滤光片上。,（,3,）为了延长紫外灯的使用寿命，请在白光下调整胶块位置，尽量减少紫外灯的开关次数。,（,4,）打开暗箱门时要上拉到顶，防止自动滑落。,（,5,）为了防止,EB,污染，凝胶成像系统的电脑操作必须徒手，不得戴手套。,6、注意事项,51,仪器四、微波炉,1,、作用：用于熬制琼脂糖胶。,2,、使用方法,用缓冲液配制所需浓度的琼脂糖凝胶，在面板上设置时间，然后按启动键。,一般熬制,3,次，第一次设置,20,秒，第二次,10,秒，第三次,5,秒，每次到时间后取出摇匀，并观察溶解情况。胶要溶解到透明状，不能有颗粒，否则影响电泳效果。,仪器四、微波炉1、作用：用于熬制琼脂糖胶。,52,机械面板微波炉,电脑板微波炉,机械面板微波炉电脑板微波炉,53,3,、注意事项,（,1,）在没有放入胶之前，请不要启动，以免空载运行时损坏磁控管。,（,2,）使用器皿不能用金属和搪瓷制品，因为金属对微波有反射作用。它不仅导致微波炉加热效率降低，加热均匀性差，还会使微波与金属接触产生火花，发生危险，严重时还会损坏磁控管。,（,3,）带盖的密封容器放入炉内加热时，请拧开盖子。否则，容器内的空气会因加热后体积膨胀而产生爆裂，严重时可能产生爆炸。,（,4,） 微波炉工作时，不要将眼睛紧靠微波炉,5,厘米之内去观看微波炉工作。因为眼睛对微波最敏感，以免受到不必要的伤害。,（,5,）使用时，应掌握好时间，不要一次将时间设得太长，以免引起胶过热、热焦或起火。万一起火请勿打开炉门，只要将定时器回调到零（或按取消键）或拨掉电源插头，火就会自动熄灭。,3、注意事项,54,电泳原理,电泳的定义：,带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动的现象。,电泳的基本原理：,不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的,。,电泳技术：,利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。,电泳的作用：,主要用于蛋白质、核酸、同工酶、氨基酸、多肽等物质的分离；还可用于对分离物质的纯度和分子量的测定。,电泳原理电泳的定义：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反,55,4,、水平板电泳中常见问题与注意事项,染色必须在电泳结束后，在染色区进行，禁止在电泳槽内加,EB,染色液。,分不清正负极，导致样品跑到缓冲液中。红色为正级、黑色为负极，样品从负极跑向正极，加样孔靠近负极一端。,加样时枪头不能插入太深，防止穿透胶块，刚刚插入即可。,制胶浓度必须根据,marker,要求的浓度制备，否则小分子物质很容易跑出胶块。,在没有经验的情况下，最好设置定时，否则由于疏忽样品就可能跑出胶外。,缓冲液问题。样品必须完全溶解于上样缓冲液中（,TE,），否则不能在凝胶中移动；制胶和实际电泳采用同种缓冲液（,TAE,）；缓冲液加到凝胶上之后才能点样。,4、水平板电泳中常见问题与注意事项,56,可以同时连接4组电泳槽（并联），此时应选择稳压输出，当接多个电泳槽时，则仪器显示的电流数值为各槽电流之和。,制胶浓度必须根据marker要求的浓度制备，否则小分子物质很容易跑出胶块。,2g Tris溶于1升蒸馏水中。,注意：边条应与玻璃底部及侧边对齐！,（4）灌分离胶至上沿约23厘米处。,4、水平板电泳中常见问题与注意事项,3、水平板电泳槽（DYCP-33A型）使用方法,（9）关闭退出应用程序。,（4）灌分离胶后立即加蒸馏水覆盖；,（11）2小时内不再使用时关闭电脑，关闭暗箱电源。,10、当凝胶聚合后，取出梳子，打开搭钩，从制胶器中取出内芯，放入电泳槽底槽中，制胶过程结束。,它不仅导致微波炉加热效率降低，加热均匀性差，还会使微波与金属接触产生火花，发生危险，严重时还会损坏磁控管。,9、向凝胶内插入相应的加样梳。,稳定功率时，首先将准确的数字输进去，其它电压电流值要高于正常工作值，否则功率不能恒定。,毛细管电泳：主要用于糖类和大蛋白分子的分离,电泳技术：利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。,35mA工作电流，1mA3.,（2）将接触胶面的二块玻璃板用纱布沾着酒精顺着一个方向擦，然后晾干,再将清洗干净的凝胶玻璃放入制胶架内的PE软片上, 凹槽玻璃冲外。,样品必须完全溶解于上样缓冲液中（TE），否则不能在凝胶中移动；,(2）垂直板电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。,JY-SCZ8,型垂直板电泳槽使用方法,可以同时连接4组电泳槽（并联），此时应选择稳压输出，当接多个,57,1,、使用去污剂将凝胶玻璃板反复擦洗晒干，再用无水乙醇擦净表面。,2,、制胶时，首先挑选适合凝胶厚度的电泳玻璃，采取凹形玻璃板（简称凹板）在内芯内侧、矩形玻璃板（简称平板）在内芯外侧的方向，顺着内芯一侧的紧固侧板小心放入。,特别注意,如果将凹板和平板的方向装反（平板在内，凹板在外），将无法直接电泳，需要再次移动玻璃。,3,、选择平整操作台面（建议在玻璃板上操作），当玻璃放入内芯后，确认凹、平板的底部边缘均与台面对齐，再拧紧紧固旋钮。,特别注意,使凹板、平板的底部边缘均与桌子上的玻璃台面对齐是密封的重要条件。如果是初学者，建议在拧紧紧固旋钮后将内芯翻转过来，便于用眼睛观察或者用手的触摸检查是否平齐。,1、使用去污剂将凝胶玻璃板反复擦洗晒干，再用无水乙醇擦净表面,58,5,、操作方法,（,1,）打开紫外箱（暗箱）电源开关，该开关在暗 箱右后部。,（,2,）启动电脑，启动成像应用程序,Genesnap,。,（,3,）上拉暗箱门，紫外成像时在蓝色玻璃板上放入染色后的凝胶。,（,4,）关上暗箱门。,点击,点击应用程序,启动应用程,序后的屏幕,59,（,5,）从左侧选择光源，紫外成像用紫外透射仪,(transluminator),，白光成像使用上部光源,(upper),或底部光源,(lower),。,（,7,）再次点击成像。,点击成像,（5）从左侧选择光源，紫外成像用紫外透射仪(translum,60,（,6,）点击左侧上部显示图像，可按“,-”,、“,+”,依次调节光圈、图像缩放大小、调节焦距。,光圈,图像缩放,焦距,（6）点击左侧上部显示图像，可按“-”、“+”依次调节光圈,61,主要由装有铂丝电极和缓冲液的主槽、凝胶托盘、试样格（梳子）、挡板与电泳导线组成。,将未知样品的光密度与已知浓度的样品条带的光密度进行比较，可以得到未知样品的浓度或者质量，做定量分析。,可以同时连接4组电泳槽（并联），此时应选择稳压输出，当接多个电泳槽时，则仪器显示的电流数值为各槽电流之和。,电泳实验结束先关闭电泳仪电源；,（1）点样时样品向上漂，不下沉时，尤其在加尿素（变性剂）的情况下，要用蒸馏水严格冲洗点样孔的杂质（未聚合丙烯酰胺），直至点样孔清晰透亮才可点样。,单恒（恒压）、双恒（恒流和恒压）、三恒（恒流、恒压、恒功率）。,（2）高压电泳仪（3000V）：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；,G、继续键：当电泳过程中出现人为中断停机，并希望继续接着输出工作，可以按继续键，此后电泳仪接着前面的工作时间继续工作。,硅化：先用纱布沾酒精顺时针方向擦两块玻璃板内侧，晾干后，用面巾纸沾亲水硅烷顺时针擦拭“平板玻璃”，用疏水硅烷顺时针擦“凹板玻璃”，晾干备用。,W： 0 w p=50w ,（2）使用器皿不能用金属和搪瓷制品，因为金属对微波有反射作用。,这里我们以常用的水平板电泳槽为例讲解使用方法。,凝胶成像系统可以对样品进行定量和定性的分析。,灌浓缩胶前，先用滤纸吸去覆盖水,再灌胶。,（8）装夹玻璃胶室：在本体两侧装入玻璃胶室，注意使两凹口相对。,注意：如图所示：将梳子从凝胶板的一端插入，慢慢向下用力，防止破坏鲨鱼齿的尖端。,待凝胶聚合后，轻轻拔掉挡板和梳子。,（1）打开紫外箱（暗箱）电源开关，该开关在暗 箱右后部。,2、制胶时，首先挑选适合凝胶厚度的电泳玻璃，采取凹形玻璃板（简称凹板）在内芯内侧、矩形玻璃板（简称平板）在内芯外侧的方向，顺着内芯一侧的紧固侧板小心放入。,（3）上拉暗箱门，紫外成像时在蓝色玻璃板上放入染色后的凝胶。,（,6,）点击左侧上部显示图像，可按“,-”,、“,+”,依次调节光圈、图像缩放大小、调节焦距。,光圈,图像缩放,焦距,主要由装有铂丝电极和缓冲液的主槽、凝胶托盘、试样格（梳子）、,62,