MicroRNAs-regulate-the-expression-of-the-alternati

Cliquez pour modifier le style du titre,Cliquez pour modifier les styles du texte du masque,Deuxime niveau,Troisime niveau,Quatrime niveau,Cinquime niveau,*,Cliquez pour modifier le style du titre,Cliquez pour modifier les styles du texte du masque,Deuxime niveau,Troisime niveau,Quatrime niveau,Cinquime niveau,*,*,MicroRNAs regulate the expression of,the alternative splicing factor nPTB,during the muscle development,CORDEIL Stphanie,TAMOUTOUNOUR Samira,M1 BE groupe 2,Paul L.Boutz,Geetanjali Chawla,Peter Stoilov and Douglas L.Black,Genes and development,2007,Structure cristallographique de PTB,interagissant avec lARN,INTRODUCTION,1.Notions essentielles,Lpissage alternatif,Moyen de,rgulation post-transcriptionnelle,permettant de gnrer des,isoformes,protiques,partir dun mme gne.,Mode de lexon cassette,Exon inclu,Exon exclu,Le facteur dpissage alternatif,PTB,(polypyrimidine tract binding protein),Slection ou suppression dexons dterminante pour la,diffrenciation,musculaire,Exon 1,Exon 2,Exon 3,YYYY,PTB,U2AF,Spliceosome,Exon exclusion,Exon 1,Exon 3,ARNm,Rappel:la diffrenciation musculaire,MicroRNAs,Rgulent la traduction du facteur,dpissage PTB,Large gamme dARNs non codants,Tissus spcifiques,rguls temporellement,Structure tige boucle,dun microRNA,Lpissage alternatif,joue un rle critique,dans ltablissement du modle,de,maturation,musculaire,2.Thmatique,Comprendre et caractriser la rgulation de lpissage alternatif par les microRNAs,Dfinir les mcanismes molculaires qui rgulent des phnomnes fondamentaux,tels que la diffrenciation cellulaire.,tude de la diffrenciation du muscle,Trouver des applications thrapeutiques contre des myopathies,causes par un pissage alternatif aberrant.,Contexte gnral,BUT:Comment les microRNAs rpriment lexpression de nPTB,pendant la diffrenciation des myoblastes?,Dmarche exprimentale:,-montrer la prsence diffrentielle de nPTB dans les myoblastes et les myotubes,-rechercher les sites potentiels pour les miRNAs sur lARNm de nPTB,-dterminer le mode de rpression des miRNAs sur nPTB et ses consquences sur lpissage alternatif,RESULTATS,1.Dtection de nPTB dans les cellules satellites,et au cours de la diffrenciation en myotubes,But:,Dterminer le profil dexpression de la protine nPTB au cours de la myognse,Lexpression de la protine nPTB est,limine dans les cellules musculaires diffrencies,Lexpression de PTB est,diminue,dans les,cellules musculaires diffrencies,Le milieu utilis permet la diffrenciation des C2C12 en myotubes,Dtection de la myosine marqueur de la diffrenciation,Western blot de PTB et nPTB en fonction de ltat de diffrenciation,Modle utilis:les C2C12,ligne cellulaire issue de cellules satellites adultes de la souris,Expriences ralises aprs 5 jours de diffrenciation,2.Recherche phylogntique des MRE sur lARNm de nPTB,pour la fixation de miR133 muscle-spcifique,But:,Dterminer la prsence de sites de liaison,conservs,pour les microRNA muscle-spcifiques,MiRNA,Hypothse daction des miRNA sur lARNm de nPTB,Identification de MRE pour miR-133 et miR-1/206sur la squence 3UTR de nPTB,Il existe,des MRE pour miR-133 et mir-1/206,Ces squences sont trs conserves,Il ny a,pas de complmentarit parfaite sauf,au niveau de la,seedrgion,Seed rgion,Les MicroRNA sont regroups sur 3 loci conservs de lhomme la souris(le modle dtude),Chaque paire de miR-133 et miR-1/206 est coexprime partir dun mme pre,mRNA,Localisation chromosomique des microRNA,chez lhomme et la souris,Haute conservation de miR133 et miR1/206,But:,Dterminer la conservation des squences codantes pour les MicroRNA,3.Rpression de miR133 dpendante des sites MRE,But:,montrer que miR133 rprime la traduction de lARNm de nPTB grce aux sites MRE,conservs en 3UTR.,Principe:,Myoblastes en prolifration,transfection,5,3,miR133,*,5,3,miR133,48 heures,Analyse du taux de,protines nPTB,par,Western Blot,Quantification,du taux de,protines nPTB,suite,la transfection de miR133 sauvage et mut,siRNA,La rpression de la traduction de nPTB,semble tre due une interaction de miR133,au niveau des MREs en 3UTR de lARNm,Principe:,Cellules HEK,Transfection avec les miR133 et les ARNs contrles,Muts sur 2 nt,Quantification de la luminescence,Mesure de la luminescence de la lucifrase montrant linhibition,de la traduction de nPTB par miR133 au niveau des sites MRE,Inhibition de 50%de lexpression,de la lucifrase,La rpression de la traduction de miR133 sur nPTB est mdie par les MREs.,4.Blocage de la fonction de miR133,But:,dterminer lincidence du blocage de miR133 sur la protine nPTB et donc sur lpissage,alternatif pendant la diffrenciation musculaire.,Principe,:utilisation de LNA(locked nucleic acid),Liaison connectant le carbone 2 au,4 du ribose,ARN modifi et inaccessible,Dtection des protines nPTB/PTB en prsence de miR133 bloqu,dans des cellules diffrencies,72 h,Augmentation du taux de protine,Effet du,blocage fonctionnel de miR133,sur,lpissage alternatif dexons dpendants de nPTB/PTB,dans les cellules,diffrencies,*,*,*,*,Augmentation de lexon,exclusion,Aucun effet de miR133,X2.5,X4,X