第11章组织培养

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三篇 植物细胞工程,植物组织培养,植物的快速繁殖,单倍体诱导与单倍体育种,植物胚胎培养,体细胞胚胎发生和人工种子,植物原生质体融合技术,植物染色体工程,植物转基因技术,第11章 植,物,物组织培养,植物组织培养概,念,念,发展历史,组织培养的理论,基,基础,植物组织培养培,养,养基,植物组织培养概,念,念,定义：在含有营,养,养物质及植物生,长,长物质的培养基中，培养离体植物组,织,织，并诱导使其长,成,成完整植株的技,术,术。,植物组织培养是,二,二十世纪发展起,来,来的新技术，近,三,三十年来由于组,织,织培养基础理论,研,研究的深入，发,展,展极为迅速，几,乎,乎以植物为研究,对,对象的各个分支,学,学科都在广泛进,行,行组织培养。,植物组织培养与,细,细胞培养的区别,组织培养：指从机体内取,出,出组织或细胞，,模,模拟机体内生理,条,条件，在体外进,行,行培养，使之生,存,存或,生长成组织,。,细胞培养：指动植物细胞,在,在体外条件下的,存,存活或生长，此,时,时,细胞不再形成组,织,织,。,植物组织培养：主要指用于,植物快速繁殖,的组培技术。,植物细胞培养：指以,生产次生代谢产,物,物,（色素、固醇、,生,生物碱、植物杀,虫,虫剂等）,为目的的大规模,细,细胞培养技术。,发展历史,1902年，德,国,国植物学家,Haberlandt,根据细胞学说，,提,提出单个细胞的,植,植物细胞全能性,理,理论。,并首次尝试分离,植,植物组织并培养,叶,叶片细胞，但未,成,成,功。他被称为“,植,植物组织培养之,父,父”。,1904年，,Hanning,最先成功地培养,了,了萝卜和辣根菜,的,的胚。,1922年，,Knudson,采用胚培养法获,得,得大量兰花幼苗,。,。,1934年，,White,用番茄根尖建立,起,起第一个活跃生,长,长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得,成,成功。,1948年，斯,科,科克发现腺嘌呤,生长素的比例,是,是控制芽和根形,成,成的重要条件。,1954年，,Skoog,发现一种叫激动素的细胞分裂素它,与,与生长素的比例,可,可控制器官分化,。,。,1958年，英,国,国科学家,Steward,等用胡萝卜根的,愈,愈伤组织细胞进,行,行悬浮培养，成,功,功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全,能,能性理论得到证,实,实，而且为组织,培,培养的技术程序,奠,奠定了基础。,1962年，,Murashinge,和,Skoog,在烟草培养中筛,选,选出至今仍被广,泛,泛使用的,MS,培养基。,1964-1966年，印度科,学,学家,Guha,和,Maheswari,在曼陀罗花药培,养,养中首次由花粉,诱,诱导得到了单倍体植株。,1972年，,Carlson,通过两个种的烟,草,草原生质体融合,培,培养，获得了第一个体细胞杂,交,交的杂种植株。,20世纪60年,代,代，植物组织培,养,养开始大规模应,用,用。,1960年，莫,雷,雷尔用兰属的茎,尖,尖培养，实现了,去,去病,毒和快速繁殖。,这,这一技术导致欧,美,美“兰花工业”,的,的兴起。,20世纪中期，,美,美国应用组培技,术,术获得的芹菜苗,已,已,经成功地取代了,种,种子繁殖的传统,方,方法。,我国目前在番茄,、,、辣椒、马铃薯,、,、人参、花卉、,果品生产中广泛,投,投入应用。,组织培养技术被,誉,誉为农业发展史,上,上第四次绿色革命,。,。,植物组织培养的,理,理论基础,无性繁殖,（asexual reproduction,）,）,不经生殖细胞结,合,合的受精过程，,由,由母体的一部分,直,直接产生子代的,繁,繁殖方法。后代,与,与亲代在遗传性,上,上完全一致。,林业上常用树木,营,营养器官的一部,分,分和花芽、花,药、雌配子体等,材,材料进行无性繁,殖,殖。花药、花,芽、雌配子体常,用,用组织培养法离,体,体繁殖。生根后,的植物与母株的,基,基因是完全相同,的,的。,无性繁殖的意义：,有性繁殖：,是用种子进行播,种,种繁殖，故又称种子繁殖。,优点：是繁殖数量大,，,，根系完整，生,长,长健壮。,缺点：是一些通过异,花,花授粉的花卉容,易,易发生变,异，不易保持原,品,品种的优良特征,。,。,无性繁殖：,是利用母体营养,器,器官的一部分作,为,为繁殖材料，进,行,行分生、扦插、,压,压条、嫁接繁殖,和,和组织培养快速,繁,繁殖及植物的无,融,融合生殖等，使,之,之形成一个新的,个,个体，所以又称营养繁殖。,优点：是能保持品种,的,的优良特性、生,长,长快、短期内,获得大量后代。,缺点：是繁殖方法不,如,如有性繁殖简便,。,。,植物细胞的全能性,植物细胞全能性,：,：植物细胞具有,该,该植物体全部遗,传,传的可能性，在,一,一定条件下具有,发,发育成完整植物,体,体的潜在能力。,是,是植物细胞工程,的,的理论基础。,实验表明，处于,离,离体状态的植物,活,活细胞，在一定,的,的营养物质、激,素,素和其他外界条,件,件的作用下，就,可,可能表现出全能,性,性，发育成完整,的,的植株。人工条,件,件下实现的这一,过,过程，就是植物组织培养。,植物细胞全能性,表,表现根据细胞类型不同从强到弱:,营养生长中心 形成层 ,薄,薄壁细胞 ,特,特化细胞,(筛管、导管细,胞,胞) 厚壁,细,细胞(木质化细,胞,胞) ；,根据细胞所处的组织不同从强到弱为：,顶端分生组织 居间分生组,织,织 侧生分,生,生组织 薄,壁,壁组织(基本组,织,织) 厚角,组,组织 输导,组,组织 厚壁,组,组织。,植物,细,细胞,全,全能,性,性的,表,表达,脱分,化,化,（dedifferentiation),：分,化,化的,细,细胞,在,在一,定,定条,件,件下,，,，转,变,变为,胚,胚性,状,状态,，,，重,新,新获,得,得分,裂,裂能,力,力。,愈伤,组,组织：脱,分,分化,细,细胞,经,经过,细,细胞,分,分裂,，,，产,生,生无,组,组,织结,构,构、,无,无明,显,显极,性,性、,松,松散,的,的细,胞,胞团,。,。,细胞,由,由静,止,止状,态,态被,诱,诱导,激,激活,，,，蛋,白,白质,合,合成,旺,旺盛,，,，RNA,含,含量,迅,迅速,增,增加,。,。细,胞,胞进,入,入分,裂,裂期,，,，形,成,成愈,伤,伤组,织,织。,愈伤,组,组织,的,的诱,导,导是,植,植物,细,细胞,体,体外,再,再生,的,的第,一,一步,。,。,愈伤,组,组织,的,的种,类,类,1、胚性,愈,愈伤,组,组织：,表面,光,光滑,、,、组,织,织结,构,构紧,凑,凑、,细,细胞,小,小、,再,再生,力,力强,。,。,在适,宜,宜的,培,培养,条,条件,下,下能,分,分化,出,出再,生,生植,株,株的,离,离体,培,培养,物,物。,胚性,愈,愈伤,组,组织,容,容易形成,胚,胚状,体,体。,2、非胚,性,性愈,伤,伤组,织,织：,表面,粗,粗糙,、,、组,织,织结,构,构疏,松,松、,细,细胞,大,大，,呈淡,黄,黄色,。不具,备,备产,生,生再,生,生植,株,株潜,力,力的,离,离体,培,培养,物,物。,注意,：,：,并不,是,是所,有,有的,细,细胞,脱,脱分,化,化的,结,结果,都,都必,然,然形,成,成愈,伤,伤组,织,织。有,些,些植,物,物体,的,的细,胞,胞脱,分,分化,以,以后,直,直接,形,形成,胚,胚性,细,细胞,，,，进,而,而形,成,成体,细,细胞,胚,胚。,愈伤,组,组织,内,内的,细,细胞,并,并不,都,都是,未,未分,化,化的,细,细胞,，,，即同,一,一愈,伤,伤组,织,织内,的,的细,胞,胞的,分,分化,状,状态,存,存在,一,一定,的,的差,异,异。,细胞,和,和组,织,织分,化,化与,脱,脱分,化,化的,区,区别,分化,脱分化,细胞区别,有丝分裂，无液泡及蛋白体,无丝分裂为主，出现液泡和蛋白体,形态区别,有特征，排列规则，有极性，如髓分生组织等,没有特征，排列不规则，没有极性,生理区别,有专一的功能,没有专一的功能,生化区别,有不同的化学组成和代谢方式,化学组成与代谢方式基本相同,再分化,（redifferentiation):,经脱分化的组,织,织或细胞在一,定,定的培养条件,下,下，重新分化,为,为各种类型细,胞,胞，并进一步,发,发育为完整植,株,株。,愈伤组织再分,化,化的2个途径,：,：,器官发生：将愈伤组织,先,先后置于两种,培,培养基上，分,别,别诱导形成芽,和,和根。,胚状体发生：愈伤组织形,成,成类似种子的,胚,胚的结构，产,生,生芽端结构与,根,根端结构，成,为,为胚状体。再,进,进一步发育为,成,成熟胚。,胚状体分为：,体细胞胚：来,源,源于植物二倍,体,体细胞（根、,茎,茎、叶），发,育,育为正常可育,植,植株。,生殖细胞胚：,来,来源于单倍体,大,大、小孢子细,胞,胞，发育为单,倍,倍体植株。染,色,色体加倍后可,育,育。,再分化期的细,胞,胞酶活性增强,，,，RNA和组,蛋,蛋白合成速,度加快，营养,物,物质积累。,再分化期细胞,的,的形态大小保,持,持相对稳定，,细,细胞由,平周分裂转变,为,为组织内部局,部,部分裂，形成,“,“瘤状”,或“片状”分,生,生组织。,甘蓝,辣椒,草莓,离体的植物器,官,官、组织、细,胞,胞,脱分化,愈伤组织,再分化,根,芽,植物体,植物组织培养,过,过程,植物组织培养,条,条件：,含有全部营养,成,成分的培养基,、,、一定的温度,、,、空气、无菌,环,环境、适合的PH、适时光,照,照等。,影响细胞脱分,化,化与再分化的,因,因素,激素 ：,生长素能促进维管组织形成,细胞分裂素与木质部的发生有关,激素可能是通,过,过在转录或翻,译,译水平上的调,节,节作用而影响,相,相关基因的表,达,达，从而调控,细,细胞分化。,在植物中细胞,种,种类的不同或,同,同一种细胞不,同,同的发育状态,，,，均会影响该,种,种细胞对激素,的,的反应，所以,很,很难寻找到不,同,同激素在分化,中,中作用的共同模式。,蔗糖浓度,光照与温度,光照对于维管组织的分化具有促,进,进作用，,适宜的温度对,于,于维管组织的分化是必需,的,的。,植物组织培养,特,特点, 培养条件,可,可以人为控制,组织培养采用,的,的植物材料完,全,全是在人为提,供,供的培养基质,和,和小气候环境,条,条件下进行生,长,长，摆脱了大,自,自然中四季、,昼,昼夜的变化以,及,及灾害性气候,的,的不利影响，,且,且条件均一，,对,对植物生长极,为,为有利，便于稳定地进行培,养,养生产。, 生长周期,短,短，繁殖率高,植物组织培养,是,是由于人为控,制,制培养条件，,根,根据不同植物,不,不同部位的不,同,同要求而提供,不,不同的培养条,件,件，因此生长较快。另外，植株,也,也比较小，往,往,往2030d,为,为一个周期。所以，虽然,植,植物组织培养,需,需要一定设备,及,及能源消耗，,但,但由于植物材,料,料能按几何级,数,数繁殖生产，,故,故总体来说成,本,本低廉，且能,及,及时提供规格,一,一致的优质种,苗,苗或脱病毒种,苗,苗。, 管理方便,，,，利于工厂化,生,生产和自动化,控,控制,植物组织培养,是,是在一定的场,所,所和环境下，,人,人为提供一定,的,的温度、光照,、,、湿度、营养,、,、激素等条件,，,，既利于高度,集,集约化和高密,度,度工厂化生产,，,，也利于自动,化,化控制生产。,它,它是未来农业,工,工厂化育苗的,发,发展方向。它,与,与盆栽、田间,栽,栽培等相比省,去,去了中耕除草,、,、浇水施肥、,防,防治病虫害等,一,一系列繁杂劳,动,动，可以大大,节,节省人力、物,力,力及田间种植,所,所需要的土地,。,。,植物组织培养,营养条件,培,培养基(culturemedium),是植物组织培,养,养的重要基质,。,。在离体培养,条,条件下，不同,种,种植物的组织,对,对营养有不同,的,的要求，甚至,同,同一种植物不,同,同部位的组织,对,对营养的要求,也,也不相同。因,此,此，没有一种培养,基,基能够适合所,有,有类型的植物,组,组织或器官，在建立一项,新,新的培养系统,时,时，首先必须找到合适,的,的培养基，培养才有可,能,能成功。,培养基的种类,培养基有许多,种,种类，根据不,同,同的植物和培,养,养部位及不同,的,的培养目的需,选,选用不同的培,养,养基。,Sacks(1680)和Knop(1681)，对绿,色,色植物的成,分,分进行了分,析,析研究，根,据,据植物从土,中,中主要是吸,收,收无机盐营,养,养，设计出,了,了由无机盐,组,组成的Sacks,和,和Knop,溶,溶液，至今仍在,作,作为基本的,无,无机盐培养,基,基得到广泛,应,应用。,White,培,培养基在40年代,用,用得较多，,现,现在还常用,。,。,60和70,年,年代则大多,采,采用MS等高浓,度,度培养基，可以保证,培,培养材料对,营,营养的需要,，,，并能生长,快,快、分化快,。,。,目前，常用,的,的培养基及,特,特点如下：,(1)MS,培,培养基,1962年,，,，由Murashige和Skoog为培养,烟,烟草细胞而,设,设计的。特,点,点：,无机盐和离,子,子浓度较高,，,，是较稳定,的,的平衡溶液,。,。由于浓度,高,高，在配制,中,中某些成分,有,有些出入，,也,也不致影响,培,培养基的离,子,子平衡。,硝酸盐含量,较,较其他培养,基,基高。,养分的数量,和,和比例较合,适,适，可满足,植,植物的营养,和,和生理需要,。,。,广泛地用于,植,植物的器官,、,、花药、细,胞,胞和原生质,体,体培养，效,果,果良好。,(2)B,5,培养基,是1968,年,年由Galmborg,等,等为培养大,豆,豆根细胞而,设,设计的。其,主,主要特点是,含,含有较低的铵，对不少培,养,养物的生长,有,有抑制作用,。,。双子叶植,物,物，特别是,木,木本植物在B,5,培养基上生,长,长更适宜。,(3)White培养,基,基,是1943,年,年由White为培养,番,番茄根尖而,设,设计的。1963年又,作,作了改良，,称,称作White改良培,养,养基，提高,了,了MnSO,4,的浓度和增,加,加了硼酸。其特点是,无,无机盐数量,较,较低，适于生根培养。,（4）N,6,培养基,是1974,年,年朱至清等,为,为水稻等禾,谷,谷类作物花,药,药培养而设,计,计的。其特,点,点是成分较,简,简单，KNO,3,和（NH,4,）,2,SO,4,含量高。在,国,国内已广泛,应,应用于小麦、水稻,及,及其他植物,的,的花药培养,和,和其他组织,培,培养。,(5) KM8P培,养,养基,它是1974年为原生,质,质体培养而,设,设计的。其,特,特点是有机,成,成分较复杂,，,，它包括了,所,所有的单糖,和,和维生素，广泛用于原,生,生质融合的,培,培养。,培养基的组,成,成：,培养基的成,分,分主要可以,分,分水、无机,盐,盐、有机物,、,、天然复合,物,物、培养体,的,的支持材料,等,等五大类。,水是植物原生,质,质体的组成,成,成分，也是,一,一切代谢过,程,程的介质。,它,它是生命活,动,动过程中不,可,可缺少的物,质,质。,配制培养基,母,母液时要用,蒸,蒸馏水，以,保,保持母液及,培,培养基成分,的,的精确性，,防,防止贮藏过,程,程发霉变质,。,。,大规模生产,时,时可用自来,水,水。但在少,量,量研究上尽,量,量用蒸馏水,，,，以防成分,的,的变化引起,不,不良效果。,无机元素,大量元素,：指浓度大,于,于0.5m,molL,的,的元素等。,(1) N,是蛋白质、,酶,酶、叶绿素,、,、维生素、,核,核酸、磷脂,、,、生物碱等,的,的组成成分,，,，是生命不,可,可缺少的物,质,质。在制备,培,培养基时以NO,3,N和NH,4,N两种形,式,式供应。大,多,多数培养基,既,既含有N0,3,N又含NH,4,N。NH,4,N对植物,生,生长较为有,利,利。供应的,物,物质有KNO,3,、NH,4,NO,3,等。,(2) P,是磷脂的主,要,要成分。而,磷,磷脂又是原,生,生质、细胞,核,核的重要组,成,成部分。磷,也,也是ATP,、,、ADP等,的,的组成成分,。,。在植物组,织,织培养过程,中,中，向培养,基,基内添加磷,，,，不仅增加,养,养分、提供,能,能量，而且,也,也促进对N,的,的吸收，增,加,加蛋白质在,植,植物体中的,积,积累。常用,的,的物质有KH,2,P0,4,或NaH,2,P0,4,等。,(3) K,对碳水化合,物,物合成、转,移,移、以及氮,素,素代谢等有,密,密切关系。K增加时，,蛋,蛋白质合成,增,增加，维管,束,束、纤维组,织,织发达，对,胚,胚的分化有,促,促进作用。,但,但浓度不易,过,过大，一般,为,为13mgL为好,。,。制备培养,基,基时，常以KCL、KN0,3,等盐类提供,。,。,(4)Mg,、,、S和Ca:,Mg 是叶,绿,绿素的组成,成,成分，又是,激,激酶的活化,剂,剂；,S 是含S 氨基酸,和,和蛋白质的,组,组成成分。,Mg、S 常,以,以MgSO,4,7H,2,0提供,。,。用量,为,为13mg,L,较,较为适,宜,宜；,Ca,是,是构成,细,细胞壁,的,的一种,成,成分，Ca对,细,细胞分,裂,裂、保,护,护质膜,不,不受破,坏,坏有显,著,著作用,，,，常以CaCl,2,2H,2,O提供,。,。,微量元,素,素：,指小于0.5mmolL,的,的元素,，,，Fe,，,，B，Mn，Cu，Mo，Co等,。,。,铁是一,些,些氧化,酶,酶、细,胞,胞色素,氧,氧化酶,、,、过氧,化,化氢酶,等,等的组,成,成成分,。,。同时,，,，它又,是,是叶绿,素,素形成,的,的必要,条,条件。,培,培养基,中,中的铁,对,对胚的,形,形成、,芽,芽的分,化,化和幼,苗,苗转绿,有,有促进,作,作用。,在,在制做,培,培养基,时,时，用Fe7H,2,0和Na,2,EDTA结,合,合成螯,合,合物使,用,用。,B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，,也,也是植,物,物组织,培,培养中,不,不可缺,少,少的元,素,素，缺,少,少这些,物,物质会,导,导致生,长,长、发,育,育异常,现,现象。,有机化,合,合物,培养基,中,中若只,含,含有大,量,量元素,与,与微量,元,元素，,常,常称为基本培,养,养基（basicmedium)。,由于不,同,同的培,养,养目的,，,，往往,要,要加入,一,一些有,机,机物以,利,利于快,速,速生长,。,。常加,入,入的有,机,机成分,主,主要有,以,以下几,类,类：,碳水化,合,合物,最常用,的,的碳源,是,是蔗糖，葡萄,糖,糖和果,糖,糖也是,较,较好的,碳,碳源，,可,可支持,许,许多组,织,织很好,的,的生长,。,。,蔗糖使,用,用浓度,在,在2%,3%,，,，常用3%，,但,但在胚,培,培养时,采,采用4%-15%的,高,高浓度,，,，因蔗,糖,糖对胚,状,状体的,发,发育起,重,重要作,用,用。,不同糖,类,类对生,长,长的影,响,响不同,。,。从水,稻,稻根的,培,培养来,看,看，以,葡,葡萄糖,效,效果最,好,好，果,糖,糖和蔗,糖,糖相当,，,，麦芽,糖,糖差一,些,些。,高压灭,菌,菌时，,一,一部分,糖,糖会发,生,生分解,，,，制定,配,配方时,要,要给予,考,考虑。,维生素(vitamin),在植物,细,细胞里,主,主要是,以,以各种,辅,辅酶的,形,形式参,与,与多种,代,代谢活,动,动，对,生,生长、,分,分化等,有,有很好,的,的促进,作,作用。,植物细,胞,胞在培,养,养中通,常,常需加,入,入一至,数,数种维,生,生素。,主,主要有V,Bl,(盐酸,硫,硫胺素)、V,B6,(盐酸,吡,吡哆醇)、Vpp(,烟,烟酸),、,、Vc,（,（抗坏,血,血酸）,，,，有时,还,还使用,生,生物素,、,、叶酸,、,、V,B12,等。一,般,般用量,为,为0.11.0mgL,。,。,V,B1,对愈伤,组,组织的,产,产生和,生,生活力,有,有重要,作,作用，V,B6,能促进,根,根的生,长,长，Vpp与,植,植物代,谢,谢和胚,的,的发育,有,有一定,关,关系。,肌醇:,又叫环,己,己六醇,，,，在糖,类,类的相,互,互转化,中,中起重,要,要作用,。,。,通常可,由,由磷酸,葡,葡萄糖,转,转化而,成,成，还,可,可进一,步,步生成,果,果胶物,质,质，用,于,于构建细,胞,胞壁。,肌醇与6分子,磷,磷酸残,基,基相结,合,合形成,植,植酸，,植,植酸可,进,进一步,形,形成磷,脂,脂，参,与,与细胞膜的构建,。,。,使用浓,度,度一般,为,为,lOO,mgL，适,当,当使用,肌,肌醇，,能,能促进愈伤组,织,织的生,长,长以及胚状体,和,和芽的形成,。,。对组,织,织和细,胞,胞的繁,殖,殖、分,化,化有促,进,进作用,。,。,氨基酸,是很好,的,的有机,氮,氮源，,可,可直接,被,被细胞,吸,吸收利,用,用。,培养基,中,中最常,用,用的氨,基,基酸是甘氨酸，其他,的,的如精,氨,氨酸、,谷,谷氨酸,，,，谷酰,胺,胺、天,冬,冬氨酸,、,、天冬,酰,酰胺、,丙,丙氨酸,等,等也常,用,用。有,时,时应用,水,水解乳,蛋,蛋白或,水,水解酪,蛋,蛋白。,天然复,合,合物,其成分,比,比较复,杂,杂，大,多,多含氨,基,基酸、,激,激素、,酶,酶等一,些,些复杂,化,化合物,。,。它对细胞和,组,组织的,增,增殖与,分,分化有,明,明显的,促,促进作,用,用，但对器,官,官的分,化,化作用,不,不明显,。,。它的,成,成分大,多,多不清,楚,楚，所,以,以一般,应,应尽量,避,避免使,用,用。,1)椰乳,是椰子,的,的液体,胚,胚乳。,它,它是使,用,用最多,、,、效果,最,最大的,一,一种天,然,然复合,物,物。一,般,般使用,浓,浓度在10%,20%。它,在,在愈伤组,织,织和细,胞,胞培养,中,中有促进,作,作用。,在,在马铃薯,茎,茎尖分,生,生组织和草莓茎,尖,尖培养中,起,起明显,的,的促进,作,作用。,2)香蕉,用黄熟,的,的小香,蕉,蕉，加,入,入培养,基,基后变,为,为紫色,。,。对pH值,的,的缓冲,作,作用大。主,要,要在兰花的组织,培,培养中,应,应用，,对,对发育,有,有促进,作,作用。,3)马铃薯去掉皮,和,和芽后,，,，加水,煮,煮30min,，,，再经,过,过过滤,，,，取其,滤,滤液使,用,用。对pH,值,值缓,冲,冲作,用,用也大,。,。添,加,加后,可,可得,到,到健,壮,壮的,植,植株,。,。,4)水解,酪,酪蛋,白,白为蛋,白,白质,的,的水,解,解物,，,，主,要,要成,分,分为,氨,氨基,酸,酸。,受,受酸,和,和酶,的,的作,用,用易,分,分解,，,，使,用,用时,要,要注,意,意。,5)其他酵母,提,提取,液,液(YE)，,主,主要,成,成分,为,为氨,基,基酸,和,和维,生,生素,类,类；,麦,麦芽,提,提取,液,液、,苹,苹果,和,和番,茄,茄的,果,果汁,、,、黄,瓜,瓜的,果,果实,、,、未,熟,熟玉,米,米的,胚,胚乳,等,等。,遇,遇热,较,较稳,定,定，,大,大多,在,在培,养,养困,难,难时,使,使用,，,，有,时,时有,效,效。,植物,生,生长,调,调节,物,物,植物,激,激素,是,是植,物,物新,陈,陈代,谢,谢中,产,产生,的,的天,然,然化,合,合物,，,，它,能,能以,极,极微,小,小的,量,量影,响,响到,植,植物,的,的细,胞,胞分,化,化、,分,分裂,、,、发,育,育，,影,影响,到,到植,物,物的,形,形态,建,建成,、,、开,花,花、,结,结实,、,、成,熟,熟、,脱,脱落,、,、衰,老,老和,休,休眠,以,以及,萌,萌发,等,等许,许,许多,多,多的,生,生理,生,生化,活,活动,，,，在,培,培养,基,基的,各,各成,分,分中,，,，植物,生,生长,调,调节,物,物是,培,培养,基,基的,关,关键,物,物质,，,，对,植,植物,组,组织,培,培养,起,起着,决,决定,性,性作,用,用。,生长,素,素类(auxin),生长,素,素主,要,要被,用,用于,诱,诱导,愈,愈伤,组,组织,形,形成,，,，诱,导,导根,的,的分,化,化和,促,促进,细,细胞,伸,伸长,生,生长,。,。在,促,促进,生,生长,方,方面,，,，根对,生,生长,素,素最,敏,敏感。在,极,极低,的,的浓,度,度下,，,，就,可,可促,进,进根,的,的生,长,长，,其,其次,是,是茎,和,和芽,。,。组,织,织培,养,养中,常,常用,人,人工,合,合成,的,的生,长,长素,类,类物,质,质。,IAA(吲,哚,哚乙,酸,酸),是,是天,然,然存,在,在的,生,生长,素,素，,亦,亦可,人,人工,合,合成,，,，其,活,活力,较,较低,，,，是,生,生长,素,素中活力最弱的激素，对,器,器官形成的副作用小，高温高压,易,易被破坏，,也,也易被细胞,中,中的IAA,分,分解酶降解,，,，受光也易,分,分解。,NAA(萘乙酸),在,在组织培养,中,中的作用比IAA高出3-4倍，,且,且由于可大,批,批量人工合,成,成，耐高温高压,，,，不易被分,解,解破坏，所以应用,较,较普遍。NAA广泛用于生根，并与细胞分,裂,裂素互作促,进,进芽的增殖,和,和生长。,IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长,调,调节物质。,2，4D(2，4,二,二氯苯氧乙,酸,酸)作用比IAA高10倍，特别,在,在促进愈伤组,织,织的形成上活力最高,，,，但它强烈抑制芽的形,成,成，影响器官,的,的发育。适,宜,宜的用量范,围,围较狭窄，,过,过量常有毒,效,效应。,细胞分裂素,类,类 ( cytokinin ),这类激素是,腺,腺嘌吟的衍,生,生物，包括6BA(6苄基氨,基,基嘌呤)、Kt (kinetin 激动素)、Zt(zeatin 玉米,素,素)等。其,中,中Zt活性,最,最强，但非,常,常昂贵，常,用,用的是6BA。,在培养基中,添,添加细胞分,裂,裂素有三个,作,作用：,诱导芽的,分,分化促进侧,芽,芽萌发生长,。,。,促进细胞,分,分裂。,抑制根的,分,分化。,因此，多用,于,于诱导不定芽,的,的分化和茎、苗的,增,增殖，而在,生,生根培养时,使,使用较少。,赤霉素类(gibberellic acid，GA),有20多种,，,，培养基中,添,添加的是GA,3,，主要用于促进幼苗茎,的,的伸长生长，促进不定,胚,胚发育成小,植,植株；,赤霉素和生,长,长素协同作,用,用，对形成层,的,的分化有影,响,响，当生长,素,素赤霉素,比,比值高时，,有,有利于木质,部,部分化；比,值,值低时，有,利,利于韧皮部,分,分化；,赤霉素还用,于,于打破休眠，促进种子,、,、块茎、鳞,茎,茎等提前萌,发,发。一般在,器,器官形成后,，,，添加赤霉,素,素可促进器,官,官或胚状体,的,的生长。,激素配比模,式,式,生长素与细,胞,胞分裂素的,比,比例决定着,发,发育的方向。如为了促,进,进芽器官的,分,分化，应降,低,低生长素的,浓,浓度，或调,整,整培养基中,生,生长素与细,胞,胞分裂素的,比,比例。,高,有,有利于根的,形,形成和,愈伤组织的,形,形成,生长素/分,裂,裂素,适,适中 有,利,利于根、芽,的,的分化,低,有,有利于芽的,形,形成,在组织培养,中,中生长调节,物,物质的使用,浓,浓度，因植,物,物的种类、,部,部位、时期,、,、内源激素,等,等的不同而,异,异，一般生长素浓度,的,的使用为0.05-5mgL，细胞分裂素0.0510mgL。,Growth medium is optimised forregeneration of plantlets,No sucrose(0%,),Sucrose reducedto 1%,Sucrose increased to5%,The explant iscompletelycovered with greenshoots, and roots are developing onthelowersurface,Veryfew shootshavedevelopedon the explant. Norootsandno callus.,Shoots developed onedgesof uppersurface, and some root developmenthas occured,Shootshave developedover the surface ofthe explant, along with roots fromthe lower surface. The result is comparable withthe control medium,tissuecultureintheAfricanViolet,NoBAP,BAPreducedto0.1mg. l,-1,NoNAA,Poor shoot development andnoroots.Extensive callusgeneration,Poor shoot development andnoroots,NAAreducedto0.1mg. l,-1,More balanced development of roots andshoots. However, undifferentiatedcallus is developingatthe edges of theexplant,Profuse development of roots anda reducednumber of shoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesofthe explant,NAAincreased to 5.0mg.l,-1,Profuse development of roots overthe explantupperand lower surface, andfewshoots.Some callus,NoMSsalts,Nosign of regenerationfrom explantatall.,MSsaltsreduced to 0.47g.l,-1,Some rootgrowth butreduced development of shoots,MSsaltsincreasedto9.52g.l,-1,Shootsdeveloped on upper surfaceofexplant.Norootsorcallus,.,培养材,料,料的支,持,持物,琼脂(agar),是由海,藻,藻中提,取,取的一,种,种高分,子,子碳水,化,化合物,，,，本身,不,不提供,营,营养,但,但却,是,是最好,的,的固化,剂,剂。,能溶解,在,在热水,中,中，成,为,为溶胶,，,，冷却,至,至40,凝固为,固,固体状,凝,凝胶。,用量在,610g/L,之间。,若,若浓度,太,太高，,培,培养基,会,会变硬,，,，营养,物,物质难,以,以扩散,到,到组织,中,中;若,浓,浓度过,低,低，凝,固,固性不,好,好。,凝固能,力,力与高,压,压灭菌,的,的温度,、,、时间,、,、pH,值,值等有,关,关，长,时,时间的,高,高温会,使,使凝固,能,能力下,降,降，过,酸,酸过碱,加,加之高,温,温会使,琼,琼脂发,生,生水解,。,。时间,过,过久，,琼,琼脂也,会,会丧失,凝,凝固能,力,力。,优点:,操,操作简,便,便，通,气,气问题,易,易于解,决,决，便,于,于观察,。,。,缺点：,培,培养物,与,与培养,基,基的接,触,触面积,小,小，各,种,种养分,在,在琼脂,中,中扩散,较,较慢，,影,影响养,分,分的充,分,分利用,；,；同时,排,排出的,一,一些代,谢,谢废物,，,，聚集,在,在吸收,表,表面，,对,对组织,产,产生毒,害,害作用,。,。市售,的,的琼脂,几,几乎都,含,含有杂,质,质，因,此,此，在,研,研究植,物,物组织,或,或细胞,的,的营养,问,问题时,，,，则应,避,避免使,用,用琼脂,。,。,其他有玻璃,纤,纤维、,滤,滤纸桥,、,、海绵,、,、脱脂,棉,棉、卡,拉,拉胶等,，,，总的,要,要求是,排,排出的,有,有害物,质,质对培,养,养材料,没,没有影,响,响或影,响,响较小,。,。,抗生物,质,质,抗生物,质,质有青,霉,霉素、,链,链霉素,、,、庆大,霉,霉素等,，,，用量,在,在520mg/L,之,之间。,添加抗,生,生物质,可,可防止,菌,菌类污,染,染，减,少,少培养,中,中材料,的,的损失,，,，尤其,是,是快速,繁,繁殖中,。,。,对于刚,感,感染的,组,组织材,料,料，可,向,向培养,基,基中注,入,入5%,10%的抗,菌,菌素。,可,可两种,抗,抗生素,混,混用。,但是抗,生,生素对,植,植物组,织,织的生,长,长也有,抑,抑制作,用,用。,活性炭,活性炭,为,为木炭,粉,粉碎加,工,工形成,的,的粉沫,结,结构，,它,它结构,疏,疏松，,孔,孔隙大,，,，吸水,力,力强，,有,有很强的,吸,吸附作,用,用。,颗粒大,小,小决定,着,着吸附,能,能力、,粒,粒度越,小,小，吸,附,附能力,越,越大。,温度低,吸,吸附力,强,强，温,度,度高吸,附,附力减,弱,弱，甚,至,至解吸,附,附。,通常使,用,用浓度,为,为0.5l0gL。,它可以,吸,吸附非,极,极性物,质,质和色,素,素等大,分,分子物,质,质，包,括,括琼脂,中,中所含,的,的杂质,，,，培养,物,物分泌,的,的酚、,醌,醌类物,质,质等。,活性炭,的,的应用,茎尖初,代,代培养,，,，加入,适,适量活,性,性炭，,可,可以吸,附,附外植,体,体产生,的,的致死,性,性褐化,物,物；活,性,性炭可,明,明显促,进,进新梢,的,的形成,和,和伸长,，,，但其,作,作用一,般,般为0.1%,0.2%，,不,不能超,过,过0.2%。,活性炭,在,在生根时有明显的促,进,进作用，其,机,机理一般认,为,为活性炭通过,减,减弱光照保,护,护了IAA，从而间接,促,促进了根的,生,生长，由于,根,根的生长加,快,快，吸收能,力,力增强，反,过,过来又促进,茎,茎、叶的生,长,长。,活性炭在胚,胎,胎培养中也,有,有一定作用,，,，如在葡萄,胚,胚珠培养时,向,向培养基加,入,入0.1%,的,的活性炭，,可,可减少组织,变,变褐和培养,基,基变色，产,生,生较少的愈,伤,伤组织。,活性炭具有,副,副作用，极,少,少量的活性,炭,炭可以完全,吸,吸附培养基,中,中的调节物,质,质。大量的,活,活性炭加入会削弱琼脂,的,的凝固能力。因此，在,使,使用时要有量的意识，使,活,活性炭发挥,其,其积极作用,。,。,培养基的选,择,择,由一种已被广泛使用,的,的基本培养,基,基(如Ms培,养,养基或B5,培,培养基)开,始,始。对这种培养,基,基做了某些,定,定性和定量,的,的小变动之后，即有,可,可能得到一,种,种能满足实,验,验需要的新培养基，选择最佳,培,培养基。,常用试验方,法,法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等。,单因子试验,单因子试验,：,：培养基中其,他,他成分都维,持,持在一般水,平,平上，只变,动,动一个因子,，,，可以找出,这,这一因子对,试,试验的影响,和,和影响的程,度,度。,例如：Ms,基,基本培养基,的,的其他成分,和,和用量都不,变,变，只变动NAA用量,观察对某,一,一培养物生,根,根的影响，,这,这种只研究,一,一个因素的,试,试验就是单,因,因子试验。,必需设置对照组,与,与试验组，试验组可,以,以有一组或,几,几组，对照,组,组也可能有,一,一组以上。,对,对照组与试,验,验组中的试,验,验个体，必,须,须在遗传性,、,、生理状态,、,、前培养条,件,件等方面，,尽,尽可能完全,一,一致。,试验中各处,理,理都要设有一定的重,复,复，随试验规,模,模和要求不,同,同，大多每,个,个项目要有410瓶,，,，每瓶至少3块培养物,或,或3丛小幼,苗,苗。,2种激素5,种,种浓度的实,验,验组合,6-BA,mg/L） 0 0.5 2.5 5 10,NAA 0 1 2 3 4 5,(mg/L) 0.5 6 7 8 9 10,2.5 11 12 13 14 15,5 16 17 18 19 20,10 21 22 23 24 25,对培养基中,两,两个或两个,以,以上因素进,行,行研究的试,验,验称为多因子实验，各个因子的,每,每个水平相,互,互搭配，构,成,成了所有可,能,能的处理组,合,合，如研究NAA和6BA的最佳浓,度,度组合，每,个,个因子各设5个浓度水,平,平(0，0.5，2.5，5，10mgL)，这两种,因,因子各种浓,度,度的所有组,合,合，就构成,了,了一个具有25项处理,的,的试验。,多因子试验,广谱实验法,广谱实验法,中,中，把培养,基,基中所有组,分,分分为4大,类,类：无机盐、有机营养物,质,质(蔗糖、氨,基,基酸和肌醇,等,等)、生长素、细胞分裂素。,对每一类物,质,质选定低(L)、中(M)、和高(H)3个,浓,浓度。4类,物,物质各3种,浓,浓度的自由,组,组合即构成,了,了一项包括81个处理,的,的实验。,81个处理,中,中，最好的,一,一个可用4,个,个字母表示,。,。例如，一,个,个包含中等,浓,浓度无机盐,，,，低等浓度,生,生长素、中,等,等浓度细胞,分,分裂素和高,等,等浓度有机,营,营养物质的,处,处理即可表,示,示为MLMH。,再试用不,同,同类型的,生,生长素和,细,细胞分裂,素,素，即可,找,找到最佳,配,配方。,培养基的,制,制备,母液的配,制,制和保存,为简便起,见,见，通常,先,先配制一,系,系列母液,，,，即贮备,液,液。所谓母液是欲,配,配制液的,浓,浓缩液，一般母,液,液配成比,所,所需浓度,高,高10-100倍,。,。,母液配制,时,时可分别,配,配成大量,元,元素、微,量,量元素、,铁,铁盐、有,机,机物和激,素,素类等。,配制时注,意,意一些离,子,子之间易,发,发生沉淀，如Ca,2+,和S0,4,2,，Ca,2+,、Mg,2+,和PO,4,3-,一起溶解,后,后，会产,生,生沉淀，,一,一定要充分溶解再放入母,液,液中。,配制母液,时,时要用蒸,馏,馏水或重,蒸,蒸馏水。,药品应选,取,取等级较高,的,的化学纯,或,或分析纯。各种药,品,品先以少,量,量水让其,充,充分溶解,，,，然后依,次,次混合。,一般配成,大,大量元素,、,、微量元,素,素、铁盐,、,、维生素,等,等母液，,其,其中维生,素,素、氨基,酸,酸类可以,分,分别配制,，,，也可以,混,混在一起,。,。母液配,好,好后放人,冰,冰箱内低,温,温保存，,用,用时再按,比,比例稀释,。,。,母液的配,制,制方法：,单配法：,将,将培养基,配,配方中的,各,各种成分,分,分别配成,一,一定浓度,的,的母液。,一,一般用a:b表示,，,，即每b,毫,毫升溶液,中,中含有a,毫,毫克溶质,。,。,混配法：,将,将几类营,养,养成分按,配,配方中的,用,用量扩大,一,一定倍数,称,称量，分,别,别溶解后,，,，每一类,混,混合在一,起,起，定容,到,到一定体,积,积，配成,混,混合母液,。,。,应将各种,成,成分记在,纸,纸上，配,制,制培养液,时,时，加进,一,一个，划,掉,掉一个，,确,确保准确,。,。,在装有培,养,养基的各,类,类玻璃器,皿,皿上写上,标,标记。,培养基的,灭,灭菌,方法：,高压蒸汽,灭,灭菌：固,体,体培养基,过滤灭菌,法,法：液体,培,培养基,高压蒸汽,灭,灭菌：,灭菌锅要,留,留有一定,空,空间，便,于,于蒸汽回,流,流。,保压时间,要,要严格，,过,过长会破,坏,坏培养基,中,中的化学,物,物质。,在101.3kPa消毒1540min.,植物材料,的,的清洗和,灭,灭菌,从外界或,室,室内选取,的,的植物材,料,料，都不,同,同程度地,带,带有各种,微,微生物，,会,会造成培,养,养基污染,。,。因此，,植,植物材料,必,必须经严,格,格的表面,灭,灭菌处理,。,。,第一步：,清,清洗。,除去材料,不,不用部分,，,，将需要,的,的部分仔,细,细洗干净,，,，可用适,当,当的刷子,刷,刷洗。把,材,材料切割,成,成适当大,小,小，流水,冲,冲洗，冲,洗,洗时间视,材,材料清洁,程,程度而异,。,。易漂浮,或,或细小的,材,材料，可,装,装入纱布,袋,袋内冲洗,。,。,可加入洗衣粉清洗，然,后,后再用自,来,来水冲净,洗,洗衣粉水,。,。洗衣粉,可,可除去轻,度,度附着在,植,植物表面,的,的污物，,除,除去脂质,性,性的物质,，,，便于灭,菌,菌液的直,接,接接触。,最,最理想的,清,清洗物质,是,是表面活,性,性物质吐温。,第二步：对材料,表,表面浸润灭菌,在超净台或接种,箱,箱内完成，用70%酒精浸10,30s。,酒精具有使植物,材,材料表面被浸湿,的,的作用，但其穿,透,透力强，易杀伤,植,植物细胞，所以,浸,浸润时间不能过,长,长。有一些特殊,的,的材料，如果实,、,、花蕾等，以及,主,主要取用内部的,材,材料，则可只用70%酒精处理,稍,稍长的时间。,第三步：用灭菌,剂,剂处理,表面灭菌剂的种,类,类较多，可根据,情,情况选取12,种,种使用。,灭菌剂,使用浓度(%),持续时间（min）,去除的难易,效果,次氯酸钙,910,530,易,很好,次氯酸钠,2,530,易,很好,氯化汞,0.11,58,较难,最好,抗菌素,450mg/L,3060,中,较好,常用灭菌剂使用,浓,浓度及效果比较,表,表,灭菌剂应现配现,用,用，氯化汞可短,期,期内贮用。,次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产,生,生氯气来杀菌的，故灭,菌,菌时用广口瓶加,盖,盖较好；,升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；,但,但难以去除升汞,残,残毒，应当用无,菌,菌水涮洗810次，每次不少,于,于3min，尽,量,量去除残毒。,过氧化氢是分解释放原子,态,态氧来杀菌的，这种,药,药剂残留的影响,较,较小，灭菌后用,无,无菌水涮洗34次即可,在灭菌液中加吐温80（Tween80）效果较好,，,，主要作用是使,药,药剂更易于展布,，,，更易浸入到灭,菌,菌材料表面。应,注,注意吐温的用量,和,和灭菌时间，一,般,般加入灭菌液的O.5%。,最后一步：是用,无,无菌水涮洗,无菌水涮洗作用,是,是免除消毒剂杀,伤,伤植物细胞的副,作,作用。,涮洗要每次3min左右，视采,用,用的消毒液种类,，,，涮洗3-l0,次,次左右。,接 种,(1)在超净台,上,上，将灭菌后的,材,材料放置在灭过,菌,菌的4层,纱布上或滤纸上,干,干燥。,(2)吸干后，,对,对材料进行适当,的,的切割。如叶片,切,切,成0.5cm见,方,方的小块；茎切,成,成含有一个节的,小,小段。,微茎尖要剥成只,含,含l2片幼叶,的,的茎尖大小等。,在,在,接种过程中要经,常,常灼烧接种器械,，,，防止交叉污,染。,(3)将切割好,的,的外植体插植或,放,放置到培养基上,。,。,材料放置方法除,茎,茎尖、茎段要正,放,放(尖端向上),外,外，其他尚无统,一,一要求。,放置材料数量倾,向,向少放，每次接,种,种以一支试管放,一,一枚组块为宜。,种质保存,概念：,种质：是决定生,物,物遗传性状，并,将,将遗传信息,从亲代传递给子,代,代的遗传物质。,种质保存的方法按保存的地理位,置,置分为原地保存,和,和异地保存 。,原地保存是在原有的生态,环,环境条件下,就,就地保存, 自,我,我繁殖品种资源,。,。野生品种资源,采,采用这种方式保,存,存, 如建立自,然,然保护区、天然,公,公园等。,异地保存是将种子或植株,保,保存于原产地以,外,外的地区,这种,保,保存可采用植物,园,园、种质园、种,质,质库等形式或采,用,用试管保存形式,。,。,按照保存的具体,方,方法 , 品种,资,资源的保存可分,为,为：,种植保存,贮藏保存,试管保存,基因文库保存,1、种植保存品种资源材料每,隔,隔一定时间播种,一,一次, 即种植,保,保存。,种,种植条件尽可,能,能与原产地相似, 尽可能避,免,免或减少天然杂,交,交和人为混杂。,尽,尽可能地保持原,品,品种的遗传特点,和,和群体结构。,2 贮藏保存,贮藏保存就是用,控,控制贮藏条件(,主,主要是温度和,湿,湿度) 的方法, 来保持品种,资,资源种子的生活,力,力。,长,长期贮藏保存种,子,子生活力的技术,关,关键是低温和干燥, 通过控制种,子,子周围环境中的,温,温度和湿度 ,迫,迫使种子处于,代,代谢作用的最低,限,限度。,3、基因文库保,存,存,利用DNA重组,技,技术，将种质材,料,料的总DNA或,染,染色体所有片断,随,随机连接到载体,上,上，然后转移到,寄,寄主细胞中，通,过,过细胞增殖，构,成,成各个DNA片,断,断的克隆系。,超低温保存,一、超低温保存,的,的基本原理,在液氮中（-196），几乎,所,所有的细胞代谢,活,活动停止，仅保存细胞的活力,和,和形态发生的潜,力,力。当解冻后，能,够,够恢复再生能力,。,。,超低温通常指低,于,于一80,的低温，保存介,质,质或容器有干冰(一79,)、,超低温冰箱(-80-150,),、液氮(-196,),和液氮蒸气相(-140,),等，其中液氮最,常,常用。,二、常规超低温,保,保存技术,7、保存材料复,苏,苏培养,1、保存材料的,选,选择,2、冷冻前材料,预,预处理,3、添加冷冻防,护,护剂,4、材料冷冻的,方,方法,5、材料保存,6、保存材料解,冻,冻,1、保存材料的,选,选择,细胞分裂时体积,减,减小，胞内自由,水,水含量下降，细,胞,胞抗寒能力会提,高,高，因此在保存,前,前，要加速传代,，,，提高分裂细胞,的,的比例。,花粉、茎尖分生,组,组织、芽、种胚,、,、小植株、愈伤,组,组