干扰素的生产工艺

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,中文名称：,干扰素,英文名称：,interferon;IFN,药物类别：,抗肿瘤药，抗病毒药,所属类别：,生物反应调节剂,干扰素简介,70年代中期人们发现慢性乙型肝炎患者自身产生干扰素的能力低下，在应用外源性干扰素后，不仅产生了上述抗病毒作用，同时可以增加肝细胞膜上人白细胞组织相容性抗原的密度，促进T细胞溶解感染性肝细胞的效能.,现状,目前可供临床选用的干扰素种类很多。例如国产重组 IFN1型和IFN2型，进口的干扰能（IFN2b）、罗扰素（IFN2a）、惠福仁（类淋巴母细胞干扰素）及组合干扰素等等。,类别,各种亚型的干扰素-（含1或2或2a或2b）疗效近似；干扰素-（IFN）也有相似效果，但它在肌肉组织中易被灭活。干扰素-制剂进入血液后，稳定性差，确切疗效尚在观察中，但可作为干扰素-的替代制剂。,什么是干扰素（IFN）?,干扰素是由病毒和其他种类的干扰素诱导剂，通过刺激网状内皮系统（人体免疫系统的一种）、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白。这种蛋白具有多种生物活性，包括抗增殖、免疫调节、抗病毒和诱导分化作用。,干扰素的相对分子质量小，对热稳定，4可保存很长时间，-20可长期保存其活性，56则被破坏，pH（酸碱度）210范围内干扰素不被破坏。人体自然就能产生干扰素，经一定的制剂加工过程也能制造成药物-干扰素制剂。,药理作用：,1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是杀灭而是抑制病毒，它一般为广谱病毒抑制剂，对RNA和DNA病毒都有抑制作用。,2.抑制细胞增殖。干扰素抑制细胞分裂的活性有明显的选择性，对肿瘤细胞的活性比正常细胞大5001000倍。干扰素抗肿瘤效果可以是直接抑制肿瘤细胞增殖，或通过宿主机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。,3诱导细胞凋亡：干扰素可以诱导肿瘤细胞凋亡，从而杀灭肿瘤细胞。,4.干扰素对体液免疫、细胞免疫均有免疫调节作用，对巨噬细胞及NK细胞也有一定的免疫增强作用。,作用机制:,干扰素不能直接灭活病毒，而是通过诱导细胞合成抗病毒蛋白（AVP）发挥效应。干扰素首先作用于细胞的干扰素受体，经信号转导等一系列生休过程，激活细胞基因表达多种抗病毒蛋白，实现对病毒的抑制作用。,适应症：,1.用于多种恶性肿瘤，包括毛细胞白血病、慢性白血病、非何淋巴瘤、骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、晚期转移性肾癌及胰腺恶性内分泌肿瘤、黑色素瘤和Kaposi肉瘤等。,2.与其他抗肿瘤药物并用。,3.作为放疗、化疗及手术的辅助治疗剂。,4.病毒性疾病的防治。,不良反应：,1.全身反应主要表现为流感样症状，即寒战、发热和不适。,2.骨髓抑制在用药中可出现白细胞、血小板和网状红细胞减少。,3.局部反应部分患者在注射部位可出现红斑，并有压痛，24小时后即可消退。,4.其他脱发、皮疹、血沉加快、嗜睡、一过性肝损伤。偶见过敏性休克，用药前作过敏试验。,临床上常用的干扰素有哪些制剂,自然干扰素,人体白细胞重组干扰素,复合干扰素,相关药物国内生产企业,1.1b干扰素 中国预防医学科学院 卫生部长春生物制品研究所 卫生部上海生物制品研究所 深圳科兴生物制品有限公司（赛若金）,2.人2a干扰素 卫生部长春生物制品研究所 广州医学院 沈阳三生制药股份有限公司（因特芬）海南新大洲药业有限公司（贝尔芬）浙江东阳市吴守联合生物技术研究所 深圳科兴生物制品有限公司 武汉天奥制药有限公司（栓剂）,3.人2b 干扰素 长春生物制品研究所 安徽安科生物高科技有限公司(安达芬)丽珠集团苏州新宝药厂（隆化诺）哈尔滨金亚哈尔滨生物制品有限公司（利能）上海华新生物高技术有限公司 天津华立达生物工程公司 苏州新良药厂,4.人干扰素 上海生物化学研究所 中国预防医学科学院 卫生部上海生物制品研究所 第二军医大学 上海克隆生物高技术有限公司 珠海丽珠制药有限公司,干扰素生产工艺路线:,路线1：,体外诱生干扰素制备工艺,：,Sendai病毒诱导人白细胞,1989年：IFN-n3/Alferon，批准上市,产量低：1g IFN，需要 3亿ml人血白细胞,来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵,潜在的血源性病毒污染的可能性,路线2：,人源转化细胞系培养生产工艺：,1999年：IFN-n1/Wellferon,批准用于临床。,优点：首次实现大规模商业化生产。,缺点：活性低，退出临床应用。,路线3：,基因工程大肠杆菌发酵生产工艺,:,上市产品：重组人干扰素rhuIFN,1986，rhuIFN-2a，rhuIFN-2b；,1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b；,20012002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys,表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体,工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。,路线4：,动物无限细胞系培养生产工艺：,上市产品：rhuIFN-1a,1996，Avonex(Biogen)；,2002，Rebif(Serono),表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku,工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格,路线5：,基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：,宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida）,上市产品：IFN-2b/安福隆,表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子,结构和生物活性,工艺特点：,发酵周期短：几个小时,无需变性、复性过程，获得有活性产品,纯化过程：淘汰抗体亲和层析,基因工程假单胞杆菌的构建与保藏,基因工程假单胞杆菌菌种建立：,第一步：干扰素-2b基因的克隆,第二步：表达载体的构建,第三步：工程菌的构建,第一步：干扰素-2b基因的克隆,制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，,基因连接质粒,转化E.coli,筛选鉴定克隆。,测序：编码人IFN-2b基因序列,501bp，165aa。,第二步：表达载体的构建,IFN基因与表达载体连接,转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,获得序列正确表达载体,第三步：工程菌的构建,转化假单胞杆,筛选高表达、稳定遗传的工程菌,获得原始菌种,菌种库的建立与保藏,QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性,菌种检查合格后，方可投产。,干扰素,-2b,的发酵工艺过程,摇瓶培养：,取保存工作种子批菌种，室温融化,摇瓶培养：30，pH7.0，250 r/min，182h,检测：OD值和发酵液杂菌检查。,种子罐培养：,接种：接入50L种子罐，接种量10%。,培养：30，pH7.0。,控制：级联调节通气量和搅拌转速,检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。,发酵罐培养：,接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。,控制：级联调节通气量和搅拌转速。,前4h：30，pH7.0，DO为30%。,4h后：20，pH6.0，DO为60%，56.5h。,终点控制：OD值达9.01.0，5冷却水快速降温至15以下。,检测：发酵液杂菌检查,菌体收集：,连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。,菌体保存：20冰柜，不超过12个月。,检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。,干扰素-2b分离工艺过程,菌体裂解,预处理,离心,初级分离,1.菌体裂解：,裂解缓冲液：纯化水配制，210（pH7.5）,使用保护剂：EDTA，PMSF。,破碎20菌体：2厘米以下的碎块,搅拌：加裂解缓冲液，210，2hr,冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。,2.预处理-沉淀：,加絮凝剂聚乙烯亚胺:,210，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。,加凝聚剂醋酸钙溶液:,210,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。,3.离心：,连续流离心机：210，16000 r/min,收集上清液：含有重组干扰素蛋白质,杂质沉淀：121、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。,4.初级分离：,盐析:4M硫酸铵，210，搅匀,静置过夜。,离心：连续流离心机，16000 r/min,保存：收集沉淀，粗干扰素，4保存。,干扰素纯化工艺过程,溶解粗干扰素,沉淀与疏水层析,阴离子交换层析与浓缩,阳离子交换层析与浓缩,凝胶过滤层析,无菌过滤分装,1.溶解粗干扰素,配制纯化缓冲液：,超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 m滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至210。,检查:缓冲液的pH值和电导值。,溶解：,210，匀浆，完全溶解。,2.沉淀与疏水层析,等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。,疏水层析：,洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。,等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/cm，210，静置过夜,超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。,透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。,4.阳离子交换层析与浓缩,用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。,上样，相同缓冲液冲洗。,盐浓度线性梯度550 ms/cm进行洗脱,配合SDS-PAGE收集干扰素峰。,浓缩：10 ku超滤膜进行。,5.凝胶过滤层析,洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂,上样，相同缓冲液进行洗脱。,合并干扰素部分,6.无菌过滤分装,0.22 m滤膜过滤干扰素溶液,分装,20以下的冰箱中保存。,7.检测项目,干扰素鉴别试验,干扰素效价测定,蛋白质含量，纯度测定，分子量,宿主残余蛋白、残余DNA,干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列,其他：热原，内毒素，残留抗生素,演示完毕！谢谢,