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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1.2,基因工程的基本操作程序,第一步：目的基因的获取,第二步：基因表达载体的构建,第三步：将目的基因导入受体细胞,第四步：目的基因的检测与鉴定,1,）从基因所在的生物体直接获取,利用,PCR,技术扩增目的基因,3,）人工合成,2,）,mRNA,反转录成,cDNA,目的基因的获取,4),从基因文库中获取目的基因,用,_,切割目的基因，使其产生,。,用一定的,切割质粒，使其出现一个切口，产生,_,。,(,基因工程的核心,),将切下的目的基因片段插入质粒的,_,处，再加入适量,_,，形成了一个重组,DNA,分子,(,重组质粒,),。,限制酶,黏性末端,同种限制酶,同种,黏性末端,切口,DNA,连接酶,基因表达载体的构建,（一）构建目的,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。,（二）构建零件及其作用,目的基因,启动子,基因表达载体的组成,RNA,聚合酶识别和结合的一段特殊结构的,DNA,片段，位于基因的首端，,RNA,聚合酶与之结合才能驱动基因转录出,mRNA,，进而获得需要的蛋白质。,终止子,标记基因,一段特殊结构的,DNA,片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。,鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,目的基因进入,_,内，并且在受体细胞内维持,_,和,_,的过程。,受体细胞,稳定,表达,将目的基因导入受体细胞,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞吸收,DNA,分子,将目的基因导入受体细胞,(,检查是否成功,),分子水平检测,个体水平鉴定：,检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了,mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,DNA,分子杂交,DNA,分子杂交,抗原,-,抗体杂交,目的基因的检测与鉴定,目的基因主要是指,_,。,编码蛋白质的结构基因,供体生物细胞,取出,DNA,用限制酶剪去多余部分,目的基因,即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来,从基因所在的生物体直接获取,mRNA,互补,DNA (,cDNA,),双链,DNA,(,即目的基因,),反转录,合成,以目的基因转录成的,mRNA,为模板，反转录成互补的单链,DNA,，,然后在,DNA,聚合酶的作用下合成双链,DNA,，,从而获得所需的基因。,逆转录酶,DNA,聚合酶,mRNA,反转录成,cDNA,蛋白质的 氨基酸序列,mRNA,的 核苷酸序列,目的基因 核苷酸序列,目的基因,化学合成,根据已知的氨基酸序列合成,DNA,：,人工合成目的基因,推测,推测,从基因文库中获取目的基因,1.,基因组文库,将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。,受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。,2.,部分基因文库,受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如,cDNA,文库。,用适当,限制酶切割,与载体连接,导入受体菌群,与载体连接,导入受体菌群,基因文库的构建,（,1,）基因组文库的构建,提取某生物,全部,DNA,许 多,DNA,片段,该生物基,因组文库,（每个受体菌含有一段不同的,DNA,片段）,（,2,）,cDNA,文库的构建,mRNA,反转录形成,该生物,cDNA,文库,mRNA,互补,DNA (,cDNA,),双链,DNA,(,即目的基因,),逆转录酶,DNA,聚合酶,（,PCR,，,polymerase chain reaction,）,PCR,扩增仪,DNA,双链复制的基本原理,一段已知目的基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定,DNA,聚合酶,(,Taq,酶）,DNA,的两条链为模板,温度控制,原理：,前提：,条件：,聚合酶链式反应,PCR,扩增过程,DNA,变性,(90-95),：双链,DNA,模板在热作用下，,断裂，形成,。,复性,(55-60),：系统温度降低，引物与,DNA,模板结合，形成局部,。,延伸,(70-75),：在,Taq,酶的作用下，从引物的,5,端,3,端延伸，合成与模板链互补的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,DNA,链,易感染双子叶植物和裸子植物。,Ti,质粒的,T-DNA,可转移至受体细胞的染色体上,农杆菌特点：,农杆菌转化法,显微注射法,含目的基因的表达载体,动物的受精卵,含目的基因的受精卵,早期胚胎,雌性动物输卵管或子宫,转基因,动物,为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？,显微,注射,分裂,分化,移 植,发育,2.,微生物作受体细胞原因：,将目的基因导入微生物细胞,3.,转化方法：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,处理细胞,细胞表达载体与感受态细胞混合,_,细胞吸收,DNA,分子。,Ca,2+,感受态,感受态,1.,常用菌：,大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等。,该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链,DNA,解开，把单链的,DNA,小片段用同位素、荧光分子或化学发光剂等进行标记，之后同被检测的,DNA,中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的,DNA,或基因。,分子杂交技术,1.,检测转基因生物的,DNA,上是否插入了目的基因,提取受体生,物全部,DNA,适当限制,酶切割,DNA,片段,用同位素标记的,目的基因片段杂交,（表明目的基因已插入）,分子杂交技术,显出杂交带,2.,检测目的基因是否转录出了,mRNA,用同位素标记的,目的基因片段杂交,显出杂交带,（表明目的基因已转录出了,mRNA,）,检测,DNA,利用的是,DNA,与,DNA,杂交，检测,mRNA,利用的是,DNA,与,mRNA,杂交。,提取受体生物的,mRNA,检测目的基因是否翻译出蛋白质,抗原,抗体杂交,提取受体生物的蛋白质,与相应抗体杂交,显出杂交带,（表明目的基因已形成蛋白质产品）,
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