神经细胞培养

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,神经细胞,(shn jn x bo),培养,第一页，共一百一十一页。,第一节：细胞培养的基本知识,1,定义：,组织培养 (,Tissue culture ) ：,细胞培养 (,cell culture)：,器官培养,(piyng),(,organ culture)：,统称为体外培养 （,In vitro),第二页，共一百一十一页。,2 组织,(zzh),或细胞培养的优点：,1）：研究对象是活细胞,2）：研究条件可以人为的控制,3）：研究的样本可以达到比较均一性,4）：研究的内容便于观察、检测和记录,5）：研究的费用相对比较经济,(jngj),6） ：可作为一些遗传物质的运载细胞,7) ：干细胞的广泛应用前景,3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在,(cnzi),差异 ；2）细胞培养存在,(cnzi),一定的不稳定性,第三页，共一百一十一页。,培养细胞学的研究,(ynji),内容,1 培养细胞学在病毒学中的应用,2 细胞生物学的基础研究: 细胞培养使细胞生物学迅速发展,3 细胞工程学的研究手段，利用细胞融合及杂交技术，进行细胞工程的研究与开发。,4 干细胞的培养及应用,5 淋巴细胞培养技术的应用,6 遗传性疾病的产前检查,7 细胞作为毒性实验及生物安全性实验的工具,8 细胞培养在现代生物技术中应用很广，如基因分离，基因测序与表达，基因转移,(zhuny),与重组，癌基因的研究等。,第四页，共一百一十一页。,4 培养细胞的特性,1）培养细胞生长方式,(fngsh),：,a,贴附生长型细胞 （大多数）,b,悬浮生长型细胞（少数）,2）培养细胞生长特点：,贴附,；接触抑制；密度依赖性,第五页，共一百一十一页。,第六页，共一百一十一页。,第七页，共一百一十一页。,5 培养细胞生长的条件,1）细胞的营养需要：,a,基本营养物质 ：,氨基酸,、维生素、碳水化合物及一些无机离子；,b,营养因子等物质,2）细胞的生存环境：,a,温度：哺乳动物,(brdngw),和人类为3537,；鸟类为38.5,b,气相及PH 值 ：O2及CO2的值：,CO2,=5%；PH=7,.27.4,c,渗透压：260320,m mol/L,第八页，共一百一十一页。,3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境！,无毒：,与细胞直接接触者,培养器皿、底物、培养基，,蒸馏水,等；,间接接触者,配制培养基的器皿、瓶盖、瓶塞等,无污染：,微生物及交叉污染,(wrn),，（霉菌污染,(wrn),常见）,第九页，共一百一十一页。,6 常用,(chn yn),的培养用液及培养基,培养用液：,水,平衡盐溶液（）（见表）作用：,消化液,胰蛋白酶液（%）,二乙烯四乙酸,(y sun),二钠（）,胶原酶： 甘氨酸 羟脯氨酸敏感,培养基：,1天然培养基（,血清,，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白）,2 合成培养基（ ,S F12,（） ）等,第十页，共一百一十一页。,常用,(chn y,n),的平衡盐,溶,溶液（g/L）,第十一页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,细胞,(xb,o),计数法：,原则,(yunz),：取0.1,ml,细胞悬液,加,加,Hanks,液0.9,ml，,混匀后滴,于,于血细胞,计,计数板上,，,， 在低,倍,倍显微镜,下,下计数四,角,角大方格,内,内细胞。,计,计数过程,中,中对于大,方,方格边缘,压,压线按照,数,数上不数,下,下，数左,不,不数右的,原,原则。,细胞浓度=,4个大方,格,格,(fn, ),内细胞数,4,10,4,稀释倍数=,细胞数/,ml,第十二页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,细胞,(xb,o),活性的检,查,查,台盼蓝染,色,色：,0.2,ml,细胞悬液,加,加0.4,ml,台盼蓝溶,液,液混合，,滴,滴少许于,载,载波片上,，,， 低倍,镜,镜计数200细胞,，,，算比率,，,，正常,(zhngch,ng),不着色，,死,死细胞为,兰,兰色,细胞活力,（,（%）=,（,（细胞总,数,数,(zngsh),-着色细,胞,胞数）/,总,总细胞数,100%,第十三页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,第 二节,：,：神经细,胞,胞,(shn jn x, bo),体外培,养,养的,基,基本概念,和,和方案,神经细胞,培,培养的类,型,型,1 原代,培,培养,原代培养,（,（,primaryculture),：,指从活体,获,获得细胞,、,、组织,(zzh),或器官在,体,体外条件,下,下进行的,第,第一次培,养,养,传代培养(,subculture),：,当细胞持,续,续生长到,达,达一定密,度,度之后，,就,就应当将,细,细胞分成,两,两部分（,或,或更多）,至,至新的培,养,养器皿并,补,补充新的,培,培养液为,传,传代培养,。,。,2,细,细胞系培,养,养,第十四页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,一 神经,元,元的原代,培,培养,(piyng),(,Primaryculture),一、组织,来,来源：,1） 种,属,属：大鼠小鼠,家,家鸡 瓜,蟾,蟾 海,兔,兔,蜗,蜗牛,水,水蛭,等,等,2）年龄,：,：一般,(yb,n),为胚胎或,新,新生动物,组,组织,神经胶质,细,细胞：生,后,后早期,大部分神,经,经元 ：,胚,胚胎末期,颗粒细胞,：,： 生后,两,两周以内,主要根据,轴,轴突和树,突,突广泛分,枝,枝发育之,前,前培养,第十五页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,二、常用,试,试剂,1）,培养液,A DMEM,：,B F12,培养液,C DMEM/F12,培养液,D,无血清培,养,养液加神,经,经营养因,子,子,ENeurobasal,培养液,2）,D-Hank,液（其中,可,可加入牛,血,血清白蛋,白,白3,g/L）,（,（HBSS）,聚,L -,赖氨酸：,处,处理培养,皿,皿（瓶）,（,（10,mg/L,）,）5-10 min,神经营养,因,因子：,睫,睫状神经,营,营养因子,（,（,ciliaryneurotrophicfactor,CNTF):,支持交感,神,神经、副,交,交感神经,和,和感觉神,经,经的生长,与,与存活；,脑,脑源性,神,神经营养,因,因子（,brain derived neurotrophic factor ,BDNF):,支持外周,和,和中枢特,殊,殊细胞群,体,体,(qnt),的神经细,胞,胞； 硷,性,性成纤维,生,生长因子,（,（,basic fibroblastgrowthfactor,bFGF),等,第十六页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,三、培养,操,操作过程,新生13,d,大鼠或者,胚,胚胎18-19,d,大鼠，,麻醉后75%酒精,浸泡消毒,，,断头后移,入,入超净工,作,作台，无,菌,菌条件下,开,开颅，,快速,取脑，置,于,于,D-Hanks,液中，仔,细,细剥除脑,膜,膜和血管,，,，小心剥,离,离脑组织,（,（海马）,，,，放入10,ml,小瓶中,剪碎，加,入,入0.25%胰蛋,白,白酶放入37培,养,养箱，定,期,期振摇促,消,消化。消,化,化约20,min，,用,含血清的,DMEM,培养液终,止,止消化，,吸,吸管反复,轻,轻柔吹打,，,，用200目不锈,钢,钢筛网过,滤,滤，将滤,液,液分散组,成,成制成细,胞,胞悬液，1000,rpm/min,离心、洗,细,细胞两次,，,，每次10,min，,吸收细胞,悬,悬液，用,血,血球,(xuqi),记数板快,速,速计数细,胞,胞数，,用含10%胎牛血,清,清的,DMEM,培养基，,稀,稀释细胞,制,制成一定,浓,浓度细胞,悬,悬液，接,种,种于经多,聚,聚赖氨酸,处,处理过的24孔培,养,养板或培,养,养瓶内（,板,板孔放置0.8,0.8cm,的小盖玻,片,片），放,入,入5%,CO,2,培养箱，37培,养,养。,第十七页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,四、神经,元,元的鉴定,：,神经元特,异,异性烯醇,化,化酶（,Neuron specificenoloseNSE）,、,、,微管相关,(xinggu,n),蛋白（,Microtubuleassociated protein MAP2）,神经元,五、神经,元,元的纯化,：,胞嘧啶阿,拉,拉伯糖,，,，培养,2d,后用含510,mol/L,胞嘧啶阿,拉,拉伯糖的,培,培养24,hour,然后改用,常,常规培养,液,液。,特殊培养,液,液：,neurobasal,培养基,第十八页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,培养,(piyng),过程中注,意,意事项,1） 培,养,养底物的,处,处理：,多,多聚赖氨,酸,酸和多聚,鸟,鸟氨酸、,PEI,细胞外基,质,质成分（,胶,胶原）,细胞黏附,分,分子,单层非神,经,经细胞,单,单层的,胶,胶质细胞,2） 胰,蛋,蛋白酶的,作,作用时间,(shjin),：,3）细胞,合,合适的换,液,液时间：,大,大脑皮质,不,不用经,常,常换液,海马神经,元,元应半量,换,换液,胶质细胞,经,经常换液,第十九页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,六、神经,元,元的观察,：,：,刚分离出,的,的神经元,呈,呈圆形，,用,用倒置显,微,微镜观察,有,有明显的,光,光晕。,接种一般,在,在2-6,小,小时可贴,壁,壁；8小,时,时已有纤,细,细有突起,长,长出,24小时,后,后可见,(kjin),细胞体积,开,开始增大,，,，呈圆形,或,或椭圆形,。,。生长良,好,好的细胞,可,可见,(kjin),胞体周围,有,有明显的,光,光晕，立,体,体感强，,突,突起以单,、,、双突起,为,为主,培养至第4天，神,经,经元胞体,明,明显增大,，,，形态多,样,样，有些,具,具有分枝,的,的突起，,培养7天,后,后，神经,元,元形态基,本,本成熟，,具,具有光滑,的,的胞体，,发,发育良好,的,的突起,。,第二十页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,第二十一,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第二十二,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第二十三,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,MAP-2,第二十四,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第二十五,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第二十六,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,A,B,NSEstain neuron,TH stainneuron,第二十七,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,Confocallaserscan images oforgantypicslice culture from avianhippocampus,第二十八,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,Slice culture. Lucifer yellow stain(bar50m),N,第二十九,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,运动神经,元,元,Dil,标记,(bioj),第三十页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,Purkinjecell inculture(PEP-19),第三十一,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第三十二,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第三十三,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第三十四,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第三十五,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第三十六,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第三十七,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第三十八,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第三十九,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第四十页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,二、胶质,细,细胞,(xb,o),的培养,第四十一,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,胶质细胞,纤,纤维,性,性,的分类,(fnli),：,a,大胶质细,胞,胞,星,星形胶质,细,细胞,原浆性,少突胶质,细,细胞,b,小胶质细,胞,胞,周围神经,系,系统主要,是,是施万细,胞,胞,第四十二,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,根据免疫,组,组化反应,分,分类,(fnli),：,型星型胶,质,质细胞和,型星型胶,质,质细胞：,标志物,检测对象,型,细胞类型,型,少突胶质细胞,形态,多角型,星型,具有少量突起,A2B5,多聚唾液酸神经节苷脂,+,+ ,GFAP,胶质纤维酸性蛋白,+,+,Ran-2,大鼠神经抗原-2,+,GC,半乳糖脑苷脂,+,GD,3,GD,3,神经节苷脂,+ ,+,+ ,3,H-GABA,GABA,摄取,+,+,+,125,I-CYP,-,肾上腺能受体,+,NG2,300,kDa,蛋白聚糖,+,+ ,L1,细胞黏附分子,+,+,Ia,型,MHC,抗原,+ +,+,第四十三,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,研究,(ynji),胶质细胞,的,的方法,1） 从,未,未成熟的,脑,脑组织分,离,离、培养,获,获得,(hud),大量胶质,细,细胞,2）已经,开,开发出能,识,识别胶质,细,细胞的免,疫,疫学标志,物,物。,第四十四,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,利用细胞,(xb,o),培养可研,究,究胶质细,胞,胞,(xb,o),的特性,受体的表,达,达：星型,胶,胶质细胞,和,和少突胶,质,质细胞可,与,与传统的,神,神经递质,发,发生反映,。,。（,型胶质细,胞,胞可表达25种神,经,经配体的,受,受体,神经营养,因,因子的分,泌,泌：,酶的诱导,、,、蛋白质,的,的合成,神经递质,的,的摄取,髓鞘的形,成,成,神经的局,部,部免疫,(miny),反应,代谢过程,第四十五,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,胶质细胞,培,培养的局,限,限性,1,大,大多来自,于,于未成熟,大,大脑，所,以,以不能达,到,到与体内,相,相一致的,成,成熟程度,，,，即使成,年,年也可能,有,有,干细胞的存在。,其,其形态可,能,能随培养,条,条件而发,生,生变化。,存在不同,(btn),的细胞亚,群,群,其性质有,赖,赖于他们,与,与特殊神,经,经元相互,作,作用。,第四十六,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,培养,(piyng),用液,培养基：,MEM450ml+,血清 45,ml+GLU-,谷氨酰胺,青,链,链霉素溶,液,液8,ml,葡萄糖-,谷,谷氨酰胺,青,链,链霉素溶,液,液（100,ml）,：葡萄糖30,g；,谷氨酰胺100,mmol/l；,青霉素2.5,10,5,U;,链霉素2.5,10,g,胰蛋白酶,：,：0.25%,少突胶质,细,细胞的限,定,定培养液,：,：,F12,与,DMEM,（,（,高糖，4.5,g,葡萄糖/,L 1：1,混合,(hnh),后加入：,BSA,：,：,终浓度为0.66,mg/ml ,胰岛素:10,ng /ml;,孕酮:20,nmol/l;,腐胺:100,mol/l;,碳酸氢钠: 3.6,g/l;,硒: 5,ng/ml; T3: 30nmol/l;,转铁蛋白: 50,g/ml.,第四十七,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,培养的方,法,法：,1）取材,生,生后1天的大,鼠,鼠，75%酒精消,毒,毒，断头,，,，置于培,养,养皿中,2）沿纵,轴,轴剪开皮,肤,肤和颅腔,，,，取出大,脑,脑皮质，,去,去除嗅球,等,等,3,去除脑膜,，洗涤,（,（,Hanks,液）,4） 组,织,织剪成碎,块,块，37,缓慢,振荡约10,min。,5）胰蛋,白,白酶,(ydnbimi),消化,6)重复,吹,吹打，自,然,然沉淀数,次,次，收集,细,细胞悬液,第四十八,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,（或者,(huzh),6 ）移,入,入试管吹,打,打或加入,胰,胰蛋白酶,形,形成单细,胞,胞悬液,7）,加,加入,完全培养,基,基终止,8）调整,细,细胞密度10,4,10,6,/,cm,2,接种于培,养,养瓶，常,规,规,CO2,孵育箱培,养,养,9）接种3天后换,液,液，以后,每,每两天换,液,液,10）传,代,代, 0.25%,胰,胰蛋白,酶,酶消化（,覆,覆盖细胞,层,层即可）,或,或着用摇,晃,晃的方法,第四十九,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,传代时注,意,意事项：,a,细胞没有,生,生长到足,以,以,(zy,),覆盖瓶底,壁,壁大部分,表,表面,以,以前，不,要,要急于传,代,代,b,注意观察,不,不同细胞,有,有不同的,消,消化时间,；,；动作要,轻,轻柔，避,免,免损伤细,胞,胞,c,首次传代,时,时细胞数,量,量要多一,些,些，使细,胞,胞尽快适,应,应新环境,鉴定：星,形,形胶质细,胞,胞鉴定：,胶,胶质原,纤,纤维酸性,蛋,蛋白（,Glial fibrillaryacid protein GFAP，A2B5）,少突胶质,细,细胞 鉴,定,定：,GalC,（,（-galactosidase),第五十页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,神经胶质,细,细胞分离,和,和纯化,(chn hu,),流程,第0-12天 大,鼠,鼠脑皮质,(pzh),混合细胞,培,培养,第12天,预,预震荡,(zhndng),（260,rpm，1.5h,）,）,收获非贴,壁,壁细胞,震荡（260,rpm，18h）,第13天,贴,贴壁的,扁,扁平细胞,富含,型星型胶,质,质细胞,37培,养,养1,h,收获贴壁,细,细胞,富含小胶,质,质细胞,非贴壁的,，,，有突起,的,的细胞，,（,（,processing bearingPB）,富含,型星型胶,质,质细胞,含10%,胎,胎牛血清,培,培养,富含少突,交,交质细胞,化学限定,培,培养,(,oligodendrocyte-,2-,typeastrocyte, 0,-,2A,第五十一,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,其他可选,择,择,(xunz),的分离培,养,养方案,1 低密,度,度接种培,养,养获得,型胶质细,胞,胞原,理,理： 在,低,低密度时,神,神经元和,产,产生,型胶质细,胞,胞和少突,胶,胶质细胞,的,的前体细,胞,胞不能存,活,活,优点：简,单,单,缺点：1,）,）仅能获,得,得,型胶质细,胞,胞,2） 成,纤,纤维细胞,增,增殖能力,更,更强,3）部分,型胶质细,胞,胞体积变,大,大,2 利用,抗,抗原和抗,体,体结合原,理,理用流式,细,细胞仪分,选,选获得,3 小胶,质,质细胞在,营,营养,(yngyng),剥夺的情,况,况下可以,生,生长良好,第,五,五,十,十,二,二,页,页,，,，,共,共,一,一,百,百,一,一,十,十,一,一,页,页,。,。,污,染,染,(w,r,n),细,胞,胞,的,的,去,去,除,除,1,成,成,纤,纤,维,维,细,细,胞,胞,的,的,污,污,染,染,(w,r,n),：,为,为,型,星,星,型,型,胶,胶,质,质,细,细,胞,胞,主,主,要,要,污,污,染,染,细,细,胞,胞,（,（,用,用,抗,抗,纤,纤,维,维,结,结,合,合,素,素,（,（,fibronection),的,抗,抗,体,体,鉴,鉴,别,别,）,）,1,）,）,预,预,防,防,为,为,主,主,；,；,取,取,材,材,小,小,于,于,两,两,天,天,鼠,鼠,，,，,脑,脑,膜,膜,驱,驱,除,除,干,干,净,净,，,，,2,）,）,用,用,D-,缬,氨,氨,酸,酸,代,代,替,替,培,培,养,养,基,基,中,中,L-,缬,氨,氨,酸,酸,2,小,小,胶,胶,质,质,细,细,胞,胞,的,的,污,污,染,染,：,：1.,预,预,震,震,荡,荡,的,的,方,方,法,法,可,可,以,以,驱,驱,除,除,大,大,部,部,分,分,小,小,胶,胶,质,质,细,细,胞,胞,，,，2.,在,在,培,培,养,养,液,液,加,加,入,入5,mmol/l,的,L-,亮,氨,氨,酸,酸,甲,甲,酯,酯,，,，,两,两,小,小,时,时,后,后,可,可,杀,杀,死,死,小,小,胶,胶,质,质,细,细,胞,胞,3.,让,让,细,细,胞,胞,先,先,帖,帖,壁,壁,半,半,小,小,时,时,后,后,在,在,其,其,他,他,培,培,养,养,皿,皿,接,接,种,种,。,3,少,少,突,突,神,神,经,经,胶,胶,质,质,细,细,胞,胞,的,的,污,污,染,染,：,：1,）,）,含,含,血,血,清,清,培,培,养,养,；,；2,）,）,在,在,传,传,代,代,培,培,养,养,时,时,用,用,抗,抗,半,半,乳,乳,糖,糖,脑,脑,苷,苷,脂,脂,抗,抗,血,血,清,清,或,或,补,补,体,体,处,处,理,理,第,五,五,十,十,三,三,页,页,，,，,共,共,一,一,百,百,一,一,十,十,一,一,页,页,。,。,神,经,经,(sh,nj,ng),胶,质,质,细,细,胞,胞,培,培,养,养,的,的,应,应,用,用,1,受,受,体,体,表,表,达,达,研,研,究,究,：,：,星,星,型,型,胶,胶,质,质,细,细,胞,胞,和,和,少,少,突,突,胶,胶,质,质,细,细,胞,胞,可,可,与,与,传,传,统,统,的,的,神,神,经,经,递,递,质,质,发,发,生,生,(f,sh,ng),反,映,映,。,。,（,（,型,胶,胶,质,质,细,细,胞,胞,可,可,表,表,达,达25,种,种,神,神,经,经,配,配,体,体,的,的,受,受,体,体,细,胞,胞,谱,谱,系,系,的,的,研,研,究,究,：,：,研,研,究,究,O-2A,前,体,体,细,细,胞,胞,的,的,分,分,化,化,型,胶,胶,质,质,细,细,胞,胞,分,分,化,化,的,的,研,研,究,究,：,：,胎,胎,牛,牛,血,血,清,清,中,中,存,存,在,在,诱,诱,导,导,O-2A,前,体,体,细,细,胞,胞,分,分,化,化,为,为,型,胶,胶,质,质,细,细,胞,胞,的,的,血,血,清,清,因,因,子,子,称,称,为,为,星,星,型,型,胶,胶,质,质,细,细,胞,胞,诱,诱,导,导,分,分,子,子,（,（,astroglia,inducingmoleculeAIM),。,。,神,经,经,元,元,与,与,胶,胶,质,质,细,细,胞,胞,相,相,互,互,作,作,用,用,的,的,研,研,究,究,：,：,第,五,五,十,十,四,四,页,页,，,，,共,共,一,一,百,百,一,一,十,十,一,一,页,页,。,。,第,五,五,十,十,五,五,页,页,，,，,共,共,一,一,百,百,一,一,十,十,一,一,页,页,。,。,GFAP,第,五,五,十,十,六,六,页,页,，,，,共,共,一,一,百,百,一,一,十,十,一,一,页,页,。,。,humanSchwanncells,第,五,五,十,十,七,七,页,页,，,，,共,共,一,一,百,百,一,一,十,十,一,一,页,页,。,。,细,胞,胞,系,系,的,的,生,生,长,长,过,过,程,程,：,：,有,限,限,(y,uxi,n),细,胞,胞,系,系,：,原,原,代,代,培,培,养,养,传,传,代,代,期,期,衰,衰,退,退,期,期,无,限,限,细,细,胞,胞,系,系,：,：,滞,滞,留,留,期,期,指,指,数,数,增,增,长,长,期,期,平,平,台,台,期,期,三,、,、,神,经,经,细,细,胞,胞,(sh,nj,n,x,b,o),系,培,培,养,养,第,五,五,十,十,八,八,页,页,，,，,共,共,一,一,百,百,一,一,十,十,一,一,页,页,。,。,有,限,限,(y,uxi,n),细,胞,胞,系,系,无,限,限(w,xi,n),细,细,胞,胞,系,系,指,数,数,(zh,sh,),细,胞,胞,数,数,量,量,培,养,养,时,时,间,间,（,（,周,周,）,）,原,代,代,培,培,养,养,细胞系阶段,第五十九页,，,，共一百一,十,十一页。,神经,(shnjng),肿瘤细胞系,培,培养,优点,：,容易生长、,增,增殖速度快,、,、实验操作,简,简单等优点,；,；,可以用液氮,长,长期保存；,培养条件标,准,准化；,可以导入外,源,源基因；,缺点,：不能表现,出,出神经元分,化,化的许多过,程,程,(guchng),，不能植入,人,人体,。,第六十页，,共,共一百一十,一,一页。,神经细胞系,的,的建立：,1）动物诱,发,发性神经肿,瘤,瘤分离细胞,(xbo),进行培养（,PC12）,2）将连续,细,细胞系的细,胞,胞与神经系,统,统特殊区域,分,分离的细胞,融,融合。,3）利用含,有,有癌基因的,逆,逆转录病毒,感,感染神经细,胞,胞，使神经,细,细胞获得永,生,生。,第六十一页,，,，共一百一,十,十一页。,Neuroblastoma cellson glass slide,原始数据图,，,，颜色表示,(biosh),荧光强度,第六十二页,，,，共一百一,十,十一页。,Neuroblastoma cellson siliconwafer,硅片,Ra=20nm,神经母细胞,瘤,瘤细胞,生长,(shngzhng),密度很高,细胞膜电位,正,正常,活性很高,Rh-123,染色,荧光照片,100,X,第六十三页,，,，共一百一,十,十一页。,神经母细胞,(xbo),瘤细胞,(xbo),贴附良好，,开始分化并,且,且形成网络,第六十四页,，,，共一百一,十,十一页。,大鼠嗜铬细,胞,胞瘤株,PC12,的培养,(piy,ng),PC12,细胞；来源,于,于大鼠嗜铬,细,细胞瘤克隆,，,，其具有,嗜,嗜铬细胞瘤,和,和肾上腺嗜,铬,铬细胞相关,的,的表型。可,以,以合成儿茶,酚,酚氨，,在有,NGF,的作用下细,胞,胞停止增殖,，,，生长出神,经,经突起等特,点,点。,优点：1）相当,高,高的稳定性,和,和同质性,2）分化程,度,度高，对,NGF,有很强的反,应,应,3）已经具,备,备了,PC12,细胞的生物,学,学特征的背,景,景资料,所以常被广,泛,泛用于神经,细,细胞分化和,功,功能,(gngnng),的研究,第六十五页,，,，共一百一,十,十一页。,局限性,1 PC12,不能作为所,有,有类型神经,元,元模型,(mxng),2 不能接,受,受形成突触,联,联系，,3 在,NGF,处理后仍然,可,可以继续合,成,成,DNA,4 可能发,生,生自发性突,变,变和继发性,变,变异,5 长期培,养,养可能出现,明,明显不同的,细,细胞亚群而,导,导致感性趣,的,的表型消失,，,，,第六十六页,，,，共一百一,十,十一页。,一、,PC12,细胞的常规,培,培养,1）培养液,：,：85%,RPMI1640,培养液、10%马血清,、,、5%胎牛,血,血清，也可,用,用,DMEM,或,F12,2）,培养的底物,：,：,PC12,细胞对塑料,和,和玻璃黏附,能,能力,(nngl),较差,，所以必须,在,在培养前进,行,行底物处理,：,：胶原、多,聚,聚赖氨酸、,多,多聚鸟氨酸,等,等,第六十七页,，,，共一百一,十,十一页。,PC12,细胞的培养,(piy,ng),和传代,1）PC12,细胞 增倍,时,时间为2.54天,实,实际可7-10天传,代,代一次。,2),传代比例为1：3或1,：,：4,3）换液时,间,间为2-3,天,天 每次换,液,液约为2/3 的培养,液,液,4）通过机,械,械分离进行,(jnx,ng),传代培养-用吸管,轻,轻轻吹打,5）必须选,择,择生长在胶,原,原或着其他,底,底物的细胞,群,群体进行传,代,代,第六十八页,，,，共一百一,十,十一页。,PC12,细胞,(xbo),的冻存和复,苏,苏,PC12,细胞可长期,冻,冻存保种,过程： 细,胞,胞吹打从培,养,养皿脱落，,离,离心收集，,并,并悬浮于10%,DMSO,的完全培养,液,液中，用冻,存,存管分装,(fnzhun,),细胞悬液，,方,方法 为每,分,分钟-1,C,的速度降至-60,C,，,或者放入-80,C,过夜 ，可,达,达6个月。,长期冻存可,放,放置于液氮,罐,罐中。,复苏：37,C,水浴中快速,复,复温，离心,漂,漂洗去除冻,存,存液后 重,悬,悬浮于完全,培,培养液。,第六十九页,，,，共一百一,十,十一页。,PC12,细胞培养常,出,出现,(chxin),的问题,1） 细胞,生,生长不良,血,血清问,题,题或 密度,过,过低,2）细胞贴,壁,壁不良,3）对,NGF,反应,(fny,ng),不良, 细胞,群,群体变异、,NGF,失活,第七十页，,共,共一百一十,一,一页。,神经,(shnjng),生长因子（,NGF),的处理,1 神经纤,维,维的生长研,究,究：1）,细,细胞,(xbo),密度(2.510),x10,4,2),合适的底物,处,处理方案:,NGF,可减弱细胞,对,对塑料培养,皿,皿的黏附能,力,力,3)NGF,的浓度:,工,工作浓度为2,nmol/l,储存浓度为250,g/ml,，,溶剂为醋酸,钠,钠缓冲液(,ph=5),温度为-80,4)作用时,间,间 :10,天,天左右,神,经,经生长速度,为,为50,m/d,第七十一页,，,，共一百一,十,十一页。,2 神经纤,维,维再生:,研,研究,NGF,对神经再生,的,的作用。,方法：,NGF,预处理一周,吹,吹打,(chud),离心 ，去,上,上清液 并,重,重新接种，,可,可23天,重,重新形成网,络,络，可冻存,长,长期保存。,3,NGF,去除： 研,究,究,NGF,作用,方法：1）,先,先更换培养,液,液4-6次,，,，间隔培养,数,数小时再换2次，吹打,细,细胞，离心,漂,漂洗4次，,再,再接种。2,）,） 用抗,NGF,血清,第七十二页,，,，共一百一,十,十一页。,第七十三页,，,，共一百一,十,十一页。,PC-12cells,-,NGF,+,NGF,9 days,+,NGF,9 days,+,NGF,14 days,第七十四页,，,，共一百一,十,十一页。,神经元网络,在,在神经芯片,上,上的定位,(dngwi),培养,第七十五页,，,，共一百一,十,十一页。,神经界面,(jimin),芯片的研究,慕尼黑的,Max Plank,生物化学研,究,究所的,PeterFromherz,和,Gunther Zeck,将蜗牛神经,细,细胞置于一,个,个硅芯片上,，,，使用微型,塑,塑料桩子将,它,它们围在特,定,定位置。邻,近,近的细胞彼,此,此之间以及,(yj),与芯片之间,形,形成连接。(2001),在每个神经,细,细胞,(shnjnx b,o),下的刺激物,产,产生一个电,压,压的改变从,而,而激起一个,通,通过整个细,胞,胞的电冲动,产,产生。作用,于,于芯片上的,电,电冲动从一,个,个神经细胞,(shnjnx b,o),传递到另一,个,个，再传回,到,到芯片经历,一,一次硅转换,。,。该回路从,严,严格意思上,来,来说是有生,命,命的。,Fromherz 2001 nature,第七十六页,，,，共一百一,十,十一页。,改变硅片表,面,面的物理参,数,数 ，比如,表,表面粗糙度,Ra,设计成网格,状,状的图案,，,，不同区域,拥,拥有不同的,粗,粗糙度,大鼠黑质神,经,经细胞可以,(ky),在粗糙度合,适,适的位置上,生,生长,Fan,2002,第七十七页,，,，共一百一,十,十一页。,当前,(dngqin),研究进展,研究硅基芯,片,片的结构参,数,数和神经元,在,在芯片上的,贴,贴附性能的,关,关系,多种神经细,胞,胞在具有纳,米,米粗糙度的,硅,硅片上的培,养,养后的存活,和,和状态,(zhungti),分析,改变硅基底,纳,纳米粗糙度,Ra 5nm-100nm.,改变培养细,胞,胞种类,不同的神经,细,细胞可能会,有,有不同的表,面,面粗糙度要,求,求。,培养条件的,变,变化可能会,导,导致细胞对,表,表面粗糙度,要,要求的变化,，,，（有无血,清,清）,第七十八页,，,，共一百一,十,十一页。,硅片的处理,(chl,),原料,Si ,光滑面,Ra=5nm.,腐蚀,(fsh,),：用20%,HF,进行腐蚀。,Ra=20nm,t=10min.,清洗：用丙,酮,酮和浓硫酸,洗,洗除光刻胶,。,。,消毒：紫外,灯,灯照射或者,臭,臭氧消毒。,第七十九页,，,，共一百一,十,十一页。,神经细胞种,类,类,(zhngli),的选取,大鼠黑质,(hizh),细胞,nigracells,大鼠,脑,脑干,细,细胞,，,，,brainstemcells,神经,母,母细,胞,胞瘤,细,细胞,SK-N-SHneuroblastomacells,鸡胚,背,背根,神,神经,节,节细,胞,胞，,DRGcells,第八,十,十页,，,，共,一,一百,一,一十,一,一页,。,。,粗糙,度,度的,不,不同,导,导致,细,细胞,(x,b,o),的活,性,性差,异,异,Ra,50nm,Ra,20nm,第八,十,十一,页,页，,共,共一,百,百一,十,十一,页,页。,硅片,，,，Ra=20nm,Ra=20nm,细胞,内,内外,膜,膜电,位,位变,化,化也,很,很显,著,著,(xinzh),，,但是,膜,膜完,整,整性,不,不好,，,，表,现,现在,峰,峰上,有,有波,动,动。,第八,十,十二,页,页，,共,共一,百,百一,十,十一,页,页。,硅片,，,，Ra=50nm,细胞,膜,膜内,外,外电,位,位变,化,化显,著,著,(xinzh),，但,细,细胞,核,核区,域,域膜,电,电位,偏,偏高,第八,十,十三,页,页，,共,共一,百,百一,十,十一,页,页。,细胞,(x,b,o),呈现,多,多种,形,形态,分,分化,突起,明,明显,生长,出,出延,伸,伸,(y,nsh,n),很长,的伪,足,足,有多,极,极也,有,有双,极,极的,细,细胞,Rh,123,染色,荧光,照,照片,400,X,第八,十,十四,页,页，,共,共一,百,百一,十,十一,页,页。,第八,十,十五,页,页，,共,共一,百,百一,十,十一,页,页。,第八,十,十六,页,页，,共,共一,百,百一,十,十一,页,页。,第八,十,十七,页,页，,共,共一,百,百一,十,十一,页,页。,神经,干,干细,胞,胞的,分,分离,(f,nl),和培,养,养,NSC,可定,义,义为,既,既可,以,以自,我,我更,新,新又,可,可分,化,化为,中,中枢,神,神经,系,系统,内,内所,有,有细,胞,胞类,型,型的,具,具有,多,多向,分,分化,潜,潜能,的,的一,类,类细,胞,胞。,神经,(shnj,ng),干细,胞,胞的,来,来源,：,：,胚,胚,胎,胎干,细,细胞,成年,的,的侧,脑,脑室,下,下区,（,（,SVZ,区）,和,和,海,海马,齿,齿状,回,回的,颗,颗粒,细,细胞,层,层（,SGZ）,成人,嗅,嗅球,神,神经,干,干细,胞,胞,骨髓,基,基质,细,细胞,的,的转,分,分化,第八,十,十八,页,页，,共,共一,百,百一,十,十一,页,页。,神经,干,干细,胞,胞,(,Neural,stemcells),一般,处,处于,静,静止,或,或缓,慢,慢生,长的,状,状态,(,称为,(chnw,i),先祖,细,细胞,progenitorcells,或过,渡,渡细,胞,transientcells;,但是,一,一般,认,认为,先祖,细,细胞,“,progenitor,”,这一,概,概念,主,主要,指,指那,些,些比,干,干细,胞,胞更,具,具有,明确,发,发展,方,方向,的,的细,胞,胞,;,而前,体,体细,胞,胞“,precursor,”,则是,一个,不,不甚,严,严格,的,的概,念,念,泛指,那,那些,处,处于,发,发育,更,更早,期,期的,细胞,),随时,准,准备,应,应付,正,正常,损,损耗,或,或伤,害,害之,所,所需,。,。在,遇,遇,到伤,害,害的,情,情况,下,下,干细,胞,胞可,以,以很,快,快扩,展,展以,取,取代,失,失去,的细,胞,胞,但仍,保,保留,一,一定,数,数量,的,的干,细,细胞,于,于原,处,处以,备,备下,次之,用,用。,第八,十,十九,页,页，,共,共一,百,百一,十,十一,页,页。,第九,十,十页,，,，共,一,一百,一,一十,一,一页,。,。,第九,十,十一,页,页，,共,共一,百,百一,十,十一,页,页。,第九,十,十二,页,页，,共,共一,百,百一,十,十一,页,页。,诱导,干,干细,胞,胞增,殖,殖,(z,ngzh),和分,化,化的,营,营养,因,因子,bFGF,对神,经,经干,细,细胞,分,分裂,和,和增,殖,殖具,有,有重,要,要作,用,用,对,对胎,鼠,鼠纹,状,状体,海,海,马,马,人,人胚,胎,胎干,细,细胞,的,的增,殖,殖和,分,分化,有,有重,要,要作,用,用。,EGF,（,（,表皮,生,生长,因,因子,）,）对,干,干细,胞,胞有,分,分裂,和,和增,殖,殖作,用,用。,BDNF,使干,细,细胞,分,分化,为,为神,经,经元,CNTF,（,（,睫状,神,神经,营,营养,因,因子,(y,nz),）,定,定向,分,分化,为,为胶,质,质细,胞,胞。,胶质,细,细胞,生,生长,因,因子,：,：,使,使干,细,细胞,分,分化,为,为施,万,万细,胞,胞,BMP（,骨形,成,成蛋,白,白）,与,与,NGF,作用,可,可使,干,干细,胞,胞成,为,为胶,质,质细,胞,胞,T3,少突,胶,胶质,细,细胞,的,的前,体,体细,胞,胞,第九十三,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,大鼠胚胎,海,海马,(him),神经干细,胞,胞培养,一、培养,用,用液：,PBS-G,溶液：含,有,有6,g/L,葡萄糖的,PBS，ph=7.4,N2,培养基：,DMEM/F12,（,（1：1,）,）,混合，添,加,加有29,mmol/l,孕酮 ，30,mol/l,硒酸钠，100,mol/l,腐胺，3.9,mmol/,谷氨酰胺,，,，5,g/ml,胰岛素，,mol/l,转铁蛋白,。,。,多聚鸟氨,酸,酸溶液：,终,终浓度为,g/ml,bFGF,分装后-20,C,终浓度为20,ng/ml,二、细胞,分,分离和培,养,养步骤,1）孕期,16天大鼠 麻,醉,醉后腹部,用,用75%,酒,酒精消毒,，,，剪开腹,腔,腔,(fqing),取出角状,子,子宫，取,出,出胎鼠。,第九十四,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,2）胎鼠,用,用75%,酒,酒精消毒,断,断头处,死,死，剪开,颅,颅腔，解,剖,剖显微镜,下,下去除脑,膜,膜，分离,获,获取海马,组,组织。,3）海马,组,组织置于,PBS-G,溶液中,吹,吹打40,次,次 机械,分,分离,4） 离,心,心吸除上,清,清得到沉,淀,淀，用,N2,培养液重,悬,悬细胞,5）取少,量,量细胞悬,液,液滴于血,球,球计数板,上,上 进行,计,计数。,6）将细,胞,胞接种,(jizhng),于已经处,理,理过的培,养,养板上。,7）培养,液,液添加,bFGF,置37,C,，5%CO2,培养,8）3-4天换液,一,一次，培,养,养一段时,间,间传代,第九十五,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,神经,(shnjng),干细胞的,鉴,鉴定：,目前 关,于,于神经干,细,细胞的鉴,定,定还在探,讨,讨,(tnto),中，主要,有,有以下几,种,种,Nestin,BrdU,PSA-NCAM,-tubelin vimentin GAL-CA2B5,，,GFAP,此外 还,有,有,CD133,等,神经干细,胞,胞的生长,(shngzh,ng),方式：,积聚成神,经,经球并向,四,四周扩散,第九十六,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,神经干细,胞,胞培养,(piyng),的应用,大大促进,了,了神经发,育,育机制的,了,了解,使,一,一些神经,营,营养因子,直,直接应用,于,于体内细,胞,胞的增殖,和,和分化,(fnhu),有效解决,细,细胞来源,，,，免疫排,斥,斥，不能,长,长期存活,等,等问题，,使,使自体细,胞,胞移植治,疗,疗某些神,经,经退行性,疾,疾病成为,可,可能。,基因治疗,的,的载体,第九十七,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第九十八,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,第九十九,页,页，共一,百,百一十一,页,页。,Samuel I.,Stupp, Boardof TrusteesProfessor Department ofMaterials Science &EngineeringDepartmentof Chemistry, andFeinburg School ofMedicineNorthwestern University,利用纳米,技,技术培养,神,神经,(shnjng),干细胞,并诱导其,分,分化为神,经,经元,第一百页,，,，共一百,一,一十一页,。,。,.1）,制备一种,纳,纳米级的,三,三维材料,（,IKVAV -PA,）,2）这种,纳,纳米级材,料,料通过具,有,有极性的,多,多肽,(duti),分子的自,组,组装形成,3）这种,分,分子结合,一,一段具有,生,生物活性,的,的多肽链,，,，它有使,神,神经干细,胞,胞分化成,神,神经元作,用,用。,第一百零,一,一页，共,一,一百一十,一,一页。,第一百零,二,二页，共,一,一百一十,一,一页。,A Moleculargraphicsillustration ofanIKVAV-containingpeptideamphiphilemolecule,(,IKVAV,PA)anditsself-assembly into nano-fibers.,B,Scanningelectron micrographofan IKVAVnanofiber network formed byaddingcellmedia (DMEM) toa peptide amphiphile aqueous solution.,第一百零,三,三页，共,一,一百一十,一,一页。,Table 1.List ofPAmolecules,MoleculeN terminusPeptide (N toC)ChargepH7,1HCCCCGGGS(PO4)RGD- 2,2C6H11OCCCCGGGS(PO4)RGD-3,3C10H19OCCCCGGGS(PO4)RGD-3,4C16H31OCCCCGGGS(PO4)RGD- 3,5C22H43OCCCCGGGS(PO4)RGD- 3,6C10H19OAAAAGGGS(PO4)RGD-3,7C16H31OAAAAGGGS(PO4)RGD- 3,8C16H31OCCCCGGGS(PO4)-3,9C16H31OCCCCGGGS(PO4)KGE- 3,10C16H31OCCCCGGGS(PO4)RGDS-3,11C16H31OCCCCGGGSRGD-1,12C16H31OCCCCGGGEIKVAV-1,PNAS,April 16, 2002,vol.99no.8,5133,5138,第一百零,四,四页，共,一,一百一十,一,一页。,1, CandD.Thissolid containedencapsulated dissociated NPCs or clusters of the cellsknown asneurospheres,(C)cellculturemedia and (D) cerebralspinal fluid. (,E,) Micrographofan IKVAVnanofiber gel surgically extractedfromanenucleated rat eye afterintraocularinjection of the peptide amphiphilesolution.,第一百零,五,五页，共,一,一百一十,一,一页。,Cellsurvival was determinedbya fluorescent viability/cytotoxicityassay .Live cellsfluoresce greendueto the uptake and fluorescence of calcein inesterase activity;deadcells responseto intracellularfluoresce,redas aresultof the entryofethidiumhomodimer-1Cell survival was determined at(,A,) 1day,(,B,),7 days, and(,C,) 22 daysinvitro.,TheNPCsurvivedtheself-assemblyprocess andremainedviableinIKVAV-PA,第一百,零,零六页,，,，共一,百,百一十,一,一页。,IKVAV-PAcanincrease,cell bodyareasandne