-细胞化学染色检验课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验九：细胞化学染色检验（一）,一、过氧化物酶染色（POX),1. 目的:,了解过氧化物酶染色的原理、方法、注意事项和临床意义。,2. 原理: （四甲基联苯胺法）,粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶(peroxidase, POX)，POX能将底物四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)氢离子传递给H,2,O,2,，使之氧化为四甲基联苯胺蓝。四甲基联苯胺蓝又可与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，定位于细胞质酶所在部位。若无亚硝基铁氰化钠，四甲基联苯胺蓝则自我脱氢氧化成棕色的四甲基苯醌二胺沉着于酶所在部位。,实验九：细胞化学染色检验（一）,一、过氧化物酶染色（POX),3.,方法步骤,1) 取0.1TMB乙醇溶液1ml，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10l，溶液呈淡棕黄色。染色液应在临用前配制。,2) 在新鲜干燥的涂片上，加0.1TMB-亚硝基铁氰化钠饱和溶液的混合试剂0.5ml，放置1min后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml，吹匀，染色6min。,3) 直接用流水冲洗，待干，再用瑞氏染液复染1520min。,4) 流水冲洗后，待干，用油镜镜检。,5) 结果判断 在细胞质中出现蓝色或蓝黑色颗粒为阳性反应。,阴 性：无颗粒。,弱阳性：颗粒小，分布稀疏。,阳 性：颗粒略粗，分布较密集。,强阳性：颗粒粗大，密布于整个胞质中。,实验九：细胞化学染色检验（一）,一、过氧化物酶染色（POX),临床意义,POX,染色是鉴别急性粒细胞白血病,(acute,myeloblastic,leukemia, AML),、急性单核细胞白血病,(acute,monocytic,leukemia, AMOL),、 急性淋巴细胞白血病,(acute,lymphocytic,leukemia, ALL),的重要细胞化学染色方法。,AML,时白血病细胞可呈阳性反应,阳性颗粒一般较多， 较粗大，常呈局限性分布；,ALL,时白血病细胞呈阴性反应；,AMOL,时白血病细胞呈阴性或弱阳性反应，阳性时颗粒稀少、细小，呈弥散分布。,实验九：细胞化学染色检验（一）,二、过碘酸-雪夫反应(PAS),1. 目的:,了解过碘酸-雪夫反应的原理、方法、注意事项和临床意义。,2. 原理:,过碘酸-雪夫反应(Periodic acid Schiff reaction, PAS)又称糖原染色，其原理为过碘酸可将细胞内含有1,2-乙二醇基的糖类氧化而产生双醛基，后者与雪夫(Schiff)染料作用，使无色品红变为紫红色的化合物，定位于含有多糖类的胞质中。根据胞质中糖原种类及含量多少，可呈现粗细不等红色颗粒、块状物或均匀红色。,实验九：细胞化学染色检验（一）,二、过碘酸-雪夫反应(PAS),3.,方法步骤,1) 新鲜干燥的涂片用95乙醇固定10min，流水冲洗，待干。,2）加入10g/L过碘酸氧化1520min，蒸馏水冲洗，待干。,3）置雪夫染液中37(或室温)染色3060min。,4）用亚硫酸溶液冲洗3次后，再用流水冲洗23min，待干。,5）20g/L甲绿复染1020min。,6) 水洗，待干，镜检。,7) 结果判断：如在胞质中出现弥散状、颗粒状或块状红色为阳性。胞质无色或无颗粒为糖原阴性。反应强度判断标准如下：,实验九：细胞化学染色检验（一）,二、过碘酸-雪夫反应(PAS),（3）幼红细胞的分级标准：,0分胞质内无色。,1分胞质内有少数分散细小颗粒或浅红色弥漫物质。,2分胞质中有12个浓的颗粒或胞质呈弥散红色。,3分胞质中有较粗红色颗粒直至小块红色物质。,4分胞质中有粗大红色块或有粗大致密的紫红色颗粒。,（4）巨核细胞的分级标准：,0分胞质内无红色颗粒，但仍呈弥散性着色，此系其它多糖类物质。,1分少量糖原包涵体，常定位于核膜附近。,2分中等量糖原包涵体，定位于核膜处或分散在胞质中，约占胞质的1/3。,3分大量糖原包涵体分散于胞质中，占胞质1/2。,4分糖原包涵体充满整个胞质。,1 巨核细胞阳性； 2 幼红细胞阳性,1 中幼红阳性；2 晚幼红阴性；成熟粒细胞阳性,实验九：细胞化学染色检验（一）,二、过碘酸-雪夫反应(PAS),临床意义,1,）红血病、红白血病及贫血类型的鉴别：红血病、红白血病、缺铁性贫血,(iron deficiency anemia, IDA),、重型地中海贫血及骨髓增生异常综合征,(,myelodysplastic,syndrome, MDS),时幼红细胞呈强阳性反应；溶血性贫血,(hemolytic anemia, HA),、急慢性白血病、淋巴瘤时幼红细胞呈阴性反应或弱阳性反应；再生障碍性贫血,(,aplastic,anemia, AA),、巨幼细胞贫血,(,megaloblastic,anemia, MA),时幼红细胞呈阴性反应。,2,）白血病类型的鉴别：,AML,原始粒细胞与早幼粒细胞呈阴性或弱阳性反应，以弥漫性反应为主；,ALL,原、幼淋巴细胞多呈块状阳性反应,，也有少数呈阴性反应；,AMOL,原、幼单核细胞呈强阳性反应，其颗粒细小，弥散分布。,ALL-L1(左)、 L2（右）：白血病细胞呈阳性反应,实验九：细胞化学染色检验（一）,三、碱性磷酸酶染色（NAP）,目的：,掌握卡氏偶氮偶联法测定中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原理、方法、注意事项和临床意义。,2.,原理：,中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶在,pH9.6,的碱性条件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于胞质中的酶活性处。重氮盐有多种，常用的有坚牢蓝,RR,、坚牢蓝,BB,、坚牢紫酱等。,实验九：细胞化学染色检验（一）,三、碱性磷酸酶染色（NAP）,3. 方法步骤：,1) 新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s，流水轻轻冲洗3060s，待干。,2) 把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育1015min。,3) 流水冲洗1,2min，加苏木素染色液中复染58min，流水冲洗，待干，镜检。,4) 结果判断胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。,判断标准如下：,0分：胞质中无阳性染色颗粒。,1分：胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。,2分：胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。,3分：胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。,4分：胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。,5) 计算阳性率和积分值。,实验九：细胞化学染色检验（一）,三、碱性磷酸酶染色（NAP）,5. 临床意义：,临床上主要用于鉴别：,1）慢性粒细胞白血病与类白血病反应：,慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)(无继发性感染者)时，NAP积分一般明显下降，积分常13分，甚至为零分；类白血病反应(leukemoid reaction)时则显著增高，积分常200分。,2）阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血：,阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH)常降低；,再生障碍性贫血,常增高，病情好转时，NAP积分则可逐渐下降。,3）急性白血病的细胞类型： ALL增高，AML下降。,实验十：细胞化学染色检验（二）,一、铁染色（Iron stain）,1.目的,掌握骨髓铁染色(bone marrow iron stain)的原理、方法、注意事项及临床意义。,2. 原理,骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其所含的三价铁经稀盐酸处理后而游离，并能与酸性亚铁氰化钾溶液发生普鲁士蓝反应，生成蓝色亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。细胞内铁也可用此法显示，根据反应的强弱可了解骨髓中铁的含量。,实验十：细胞化学染色检验（二）,一、铁染色（Iron stain）,3.,方法步骤,1) 干燥涂片用甲醇固定10min，待干。,2) 玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，37染色30min。,3) 用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染1015min。,4) 流水冲洗，待干，镜检。,5) 结果判断,(1) 幼红细胞核呈鲜红色，胞质呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。,(2) 细胞外铁 用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。,(3) 细胞内铁 用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录胞质中含有蓝色铁颗粒的细胞(铁粒幼细胞)的百分率。根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布的情况，将铁粒幼细胞分为四型。,实验十：细胞化学染色检验（二）,一、铁染色（Iron stain）,5.临床意义：,1）鉴别缺铁性贫血和非缺铁性贫血：IDA时骨髓细胞外铁显著减少或消失，铁粒幼红细胞明显减少，所见铁粒细小色浅，且以型为主，型极少见，型以上不见。经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多，此检查是诊断IDA及指导铁剂治疗的一种辅助方法；非IDA，如HA、MA、AA等病人的细胞外铁通常增高，内铁亦增高，以型、型为主，可以见到型，罕见型。因此，有助于鉴别IDA与非IDA。,2）用于诊断铁粒幼细胞性贫血：能找到数量不等的环形铁粒幼细胞，多见粗颗粒的型与型铁粒幼细胞。,3）用于诊断伴环形铁粒幼细胞增多的MDS：骨髓中环形铁粒幼细胞15%。,实验十：细胞化学染色检验（二）,二、氯乙酸AS-D萘酚酯酶 （特异性酯酶）染色,1.目的,掌握氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色的原理、方法、注意事项及临床意义。,2. 原理,氯乙酸AS-D萘酚被细胞内氯乙酸AS-D萘酚酯酶(naphythol AS-D chloroacetate esterase,NAS-DCE)水解，产生AS-D萘酚，再与重氮盐偶联，生成不溶性的红色沉淀，定位于胞质内酶的所在部位。,实验十：细胞化学染色检验（二）,二、氯乙酸AS-D萘酚酯酶 （特异性酯酶）染色,3.,方法步骤：,1）固定 新鲜干燥的涂片在固定液中固定30s60s，或用甲醛蒸气薰蒸510min，水洗，待干。,2）放入作用液中，作用3730min，水洗。,3）苏木素或甲绿复染，水洗，待干，镜检。,4）结果判断阳性反应为红宝石色颗粒，定位于胞质中。,实验十：细胞化学染色检验（二）,二、氯乙酸AS-D萘酚酯酶 （特异性酯酶）染色,4.,注意事项：,1）冬季室温低，萘酚和坚牢紫酱GBC盐不易溶解，可放37温箱促溶。,2）配制作用液时可先将萘酚在丙酮中溶解后再加其它液体。,3）氯乙酸萘酚酯酶最适宜反应pH值为7.0,7.6；此酶不被氟化钠抑制。,4）涂片染色后不能长期保存。,5）底物配制后可能出现混浊，但不影响染色效果。,6）重氮盐可选用新品红、坚固蓝等。,实验十：细胞化学染色检验（二）,二、氯乙酸AS-D萘酚酯酶 （特异性酯酶）染色,5.,临床意义：,氯乙酸AS-D萘酚酯酶主要分布在粒细胞系和肥大细胞内，因此又称粒细胞酯酶。氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色较过氧化物酶染色更具特异性。AML时，原始粒细胞呈阳性反应；AM,O,L时白血病细胞一般呈阴性反应；ALL时白血病细胞均呈阴性反应。,AML-M1：,AML-M3: 粒细胞、Aure body 阳性,AML-M5: 中性成熟粒细胞呈强阳性为，其他原幼单核细胞均呈阴性,实验十：细胞化学染色检验（二）,三、,-丁酸萘酚酯酶染色,1.目的,-丁酸萘酚酯酶染色的原理、方法、注意事项及临床意义。,2. 原理,细胞内的-丁酸萘酚酯酶(,alpha-naphthol butyrate esterase, -NBE),在碱性条件下，将基质中的-丁酸萘酚水解，产生-萘酚，再与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于酶活性所在处。,实验十：细胞化学染色检验（二）,三、,-丁酸萘酚酯酶染色,3.方法步骤：,1）新鲜干燥涂片用甲醛蒸气固定5min，水洗，待干。,2）置于作用液(37)作用1h，水洗，待干。,3）甲绿复染2min，水洗，待干，镜检。,4）结果判断: 胞质内出现蓝色颗粒状沉淀为阳性。,4.注意事项：,1）作用液应现配现用。,2）染色的时间和温度应相对恒定。,实验十：细胞化学染色检验（二）,三、,-丁酸萘酚酯酶染色,5. 临床意义：,1）鉴别急性白血病类型： AM,O,L时，原始单核细胞可呈阳性反应，幼单核细胞和成熟单核细胞呈强阳性反应，但能被氟化钠抑制(抑制率在50%以上)；AML时，原始粒细胞一般呈阴性反应，少数呈阳性反应，但不被氟化钠抑制或仅部分轻度抑制；ALL时，原始淋巴细胞和幼淋巴细胞呈阴性反应，T-ALL原始淋巴细胞可呈阳性反应，但不被氟化钠抑制。,2）鉴别急性单核细胞白血病和组织细胞白血病：异常组织细胞可呈阳性反应，但此酶不能被氟化钠抑制；急单时，白血病细胞的阳性反应可被氟化钠抑制。,