生物化学技术2沉淀法

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 沉 淀 法,沉淀法是分离纯化生命大分子物质常用的一种经典方法；其特点是：操作简单，成本低廉,常见的方法有,盐析、有机溶剂沉淀、蛋白质沉淀、,PEG,沉淀、选择性沉淀、结晶沉淀等,掌握沉淀法的基本原理及影响因素,掌握沉淀类型及其在制备蛋白质、核酸中作用原理,熟悉沉淀法在制备蛋白质和核酸过程中的实际运用,目 的,第一节 基本原理与沉淀类型,一、基本原理,根据同一溶剂中有效成分与杂质溶解度差异。选用某种溶液系统，使所需有效成分出现最大溶解度，而杂质出现最小溶解度；或者相反，然后溶解度小者以沉淀的形式析出，达到有效成分与杂质分离的目的,根据蛋白质和核酸在组成、结构及性质等方面的明显差异，所以从生物材料中提取制备这两类物质，一般选用的试剂和操作方法也不完全相同,二、制备蛋白质,（一）盐析法,1.,原理,蛋白质在稀盐溶液中，溶解度随盐浓度的增高而上升,（盐溶）,；但当盐浓度增加到一定数值时，其溶解度有随盐浓度逐渐下降，直至蛋白质析出,（盐析）,盐析的内因是当盐浓度达到一定程度时，水的活度降低，导致蛋白质分子,表面电荷,中和，,水化膜,相继破坏，蛋白质分子聚集而析出沉淀,2.,基本步骤,选择一定浓度的盐溶液，使部分杂质“盐析”，有效成分“盐溶”（,0,25%,的（,NH,4,）,2,SO,4,）,离心分离上清,再调一定浓度盐（,25,60%,饱和盐溶液），使有效成分“盐析”,离心收集沉淀物，即为初步纯化的有效成分,（,1,）盐分级沉淀,盐的选择：,在蛋白质盐析时，常选用的盐是,（,NH,4,）,2,SO,4,（,NH,4,）,2,SO,4,的优点：,溶解度大；对温度不敏感；分离效果好（如有时一次可除去,75%,的杂蛋白）；,（,NH,4,）,2,SO,4,本身有稳定蛋白质结构的作用；价格低廉；废液还可作肥料,缺点：,与其他盐一样，若需进一步纯化，需脱盐处理,（,NH,4,）,2,SO,4,盐析,固体法,在大体积的粗提液中逐渐加入固体,（,NH,4,）,2,SO,4,，边加边搅拌，缓缓加入。在此过程中，溶液,（,NH,4,）,2,SO,4,的浓度不断升高，水分子不断与,（,NH,4,）,2,SO,4,结合，当加入的（,NH,4,）,2,SO,4,达到盐析点时，蛋白质就会沉淀出来,例：,在尿素酶抽提液中加入,（,NH,4,）,2,SO,4,，当饱和度达为,35%,时，尿素酶基本留在溶液中；但当饱和度达到,55%,时，尿素酶几乎全部沉淀,至于蛋白质溶液中加多少,（,NH,4,）,2,SO,4,使其饱和度符合蛋白质盐析，可查表,2-2,，或用下列公式计算：,（,20,）,（,25,）,表示一升溶液中需加入的,（,NH,4,）,2,SO,4,的克数,硫 酸 铵 对 尿 素 酶 的 沉 淀 作 用,调 整 硫 酸 铵 溶 液 饱 和 度 计 算 表,饱和溶液法,在,pro,溶液中加入预先调好的饱和,（,NH,4,）,2,SO,4,溶液，不同的饱和度所需的,（,NH,4,）,2,SO,4,的量用下式计算：,表示需加入,（,NH,4,）,2,SO,4,溶液的体积（,ml,）,表示原来溶液的体积,表示始、终盐的饱和度,表示需加入,（,NH,4,）,2,SO,4,溶液的饱和度,此法较固体法,温和,，但不宜用于大体积样品；否则引起样品液体积增加，计算不准确。不能达到预期的目的,透吸法,将装有,pro,溶液的透吸袋放入一定浓度大体积盐溶液中，利用半透膜透吸改变,pro,溶液中的盐浓度,由于此法的盐浓度是以连续状态变化的，可,避免局部盐浓度过高,而产生的不良影响；所以分离效果好,但透吸袋体积有限，盐析速度缓慢，（,NH,4,）,2,SO,4,消耗多等原因，致使此法仅用于要求较精确、样品体积小的试验过程中，难于放大,（,2,）制作盐析曲线,用盐析法沉淀分离,pro,样品是，,（,NH,4,）,2,SO,4,的“盐析”浓度很关键，所需的浓度范围要通过具体试验确定：,取一定体积已测含量的,pro,或酶的待分离溶液，调,pH,至稳定范围,分,610,次加入不同量的,（,NH,4,）,2,SO,4,至出现浑浊时，分离上清；如此反复,610,次，分别收集每次的沉淀,根据每次沉淀的,pro,或酶的量和相应的,（,NH,4,）,2,SO,4,浓度之间作图，即得盐析曲线（如图,2-1,）,参照表,2-3,的分级试验方法，再根据所用生物材料来源的难易程度，以及对有效成分纯度和得率的要求，先找出有利于提高纯化倍数或得率的大致框架，然后经过反复试验就能确定最佳盐析范围（即,（,NH,4,）,2,SO,4,的浓度范围）,但若生物材料来源容易，主要考虑提高纯化倍数，得率高低可视为次要因数，若材料来源困难，则主要考虑得率,典 型 盐 析 曲 线,由表可知，若生物材料来源容易，主要是考虑提高纯化倍数时，选择48%65%盐饱和分级范围，酶的纯化倍数可达3.0，而得率仅为75%；若生物材料来源较困难，主要是考虑提高收得率时，则选择45%70%甚至45%75%盐饱和分级范围，酶的收得率可达80%以上，而纯化倍数将2.4,（,3,）影响盐析的因素,盐析常数（,K,s,）,每种,pro,在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度之间存在如下关系,S,表示有效成分在水中的溶解度,;,M,表示摩尔浓度,;,Ks,表示有效成分在特定条件下的恒定值,Ks,值越大,则意味着有效成分溶解度降低的速度随着盐浓度的增加而快速降低,;,因此,对一种有效成分而言,Ks,值越大，分级范围就越窄，盐析效果就越好。,Ks,还受,pro,本身的性质、溶液的,pH,、温度及盐的种类等因素的影响,在,pH7.0,溶液中几种蛋白质的,和,K,S,常数,（溶解度,S,以,mg/ml,表示）,盐分级范围的差异性,在,pro,分离过程中，若每一种,pro,的,Ks,都很大，分离效果不一定好。因为盐析效果还与盐析范围的差异性有关,各,pro,的,Ks,大,+,盐析范围差异明显，则分离效果好；如图,2-2,中,AC,各,pro,的,Ks,大,+,盐析范围差异较小，则分离效果不好；如图,2-2,中,AB,pH,和盐浓度,有效成分的溶解度会受到,pH,和盐浓度的显著影响,例：,兔肌磷酸甘油醛脱氢酶（,pI,约,8.5,）可溶于,pH6.0,，,3.2mmol/L,的,（,NH,4,）,SO,4,溶液中，但若调节,pH,.,，则立即产生沉淀这说明选择适当,pH,的盐溶液可提高盐析的效果,一般来说，在分级盐析过程中，第一次盐析时（除去杂质），,pH,应偏离有效成分的,pI,值，而接近杂质的,pI,值；而在第二次盐析时（沉淀有效成分），,pH,应调节至接近有效成分的,pI,值,蛋白质的纯度和浓度,蛋白质存在的形式（均一的还是混合的）和浓度不同，盐析范围和溶解度也不一样。在混合的,pro,溶液中，不同分子间的相互作用会发生共沉淀作用。,Pro,浓度越高，这种现象越明显，盐析分离效果则越差；因此，一般控制样品液,Pro,浓度在,0.22%,之间为宜,其他,在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加,1mmol/L,的,EDTA-Na,2,盐，以除去沉淀剂中带入的金属离子。另外，加,（,NH,4,）,2,SO,4,沉淀的时间要控制好，过长或过短都不宜，一般控制在,2h,左右,（,4,）脱盐,常用方法：,凝胶过滤法和透析法,透析操作的注意事项：,透析袋处理,：市售透析袋要,D.W,洗净，检查无漏洞时再用。若用来去除某些易被金属离子或水解酶破坏的样品中的盐时，透析袋应用含,EDTA-Na,2,的,NaHCO,3,溶液中煮沸,10min,；并经,D.W,煮沸、漂洗后再用,透析液的选择,：透析液一般为低离子强度的中性缓冲液。对含有辅基的酶透析时，宜在透析液中加入适量的辅基或保护辅基的试剂。为防止微生物的生长，透析应在,4,进行或在透析液中添加,0.02%,的,NaN,3,(,二,),有机溶剂沉淀法,1.,原理,与盐溶液一样具有脱水作用，使,Pro,表面的水化膜破坏,降低溶剂系统的介电常数，即降低极性（而蛋白质为水溶性物质）,2.,常用有机溶剂：,MeOH,、,EtOH,、,Me,2,CO,等,3.,有机溶剂的使用量：,V,表示加入有机溶剂的体积；,V,0,表示蛋白溶液的原始体积,S,1,表示蛋白溶液中有机溶剂的浓度(体积百分浓度),S,2,表示蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度(体积百分浓度),C,表示有机溶剂的浓度（如无水,EtOH,，则,C=100,，,95%EtOH,，则,C=95,）,4.,注意事项：,中性盐作用。即在有机溶剂沉淀时，加入适量中性盐，一方面可增加,Pro,在有机溶剂中的溶解度，另一方面可防止,Pro,变性（,0.05,）；提高分级效果,低温下操作。因为有机溶剂加入水溶剂中会放热，若不注意降温，容易导致,Pro,变性,多价阳离子作用。有些,Pro,能和多价阳离子（如,Zn,+,、,Cu,+,等,）结合形成复合物，致使,Pro,在有机溶剂中溶解度降低，这对在高浓度溶剂中才能沉淀的,Pro,特别有益。如在某些,Pro,溶液中加入,0.0050.02mmol/L,的,Zn,+,，就可节省大量有机溶剂，使,Pro,有效得沉淀出来,（三）蛋白质沉淀法,1.,碱性蛋白质,（多价阳离子的碱性蛋白质）,如：鱼精蛋白，既能有效得沉淀核酸，又能沉淀,Pro,应用：,鱼精蛋白加入到部分纯化的酵母,PFK,溶液时，溶液中的酶蛋白便会吸附到鱼精蛋白,核酸沉淀物上；将沉淀物用,0.1mol/L,磷酸缓冲液洗脱，收集的,PFK,纯度提高了,9,倍,从深红螺菌中分离,PEP,羟基激酶时，加鱼精蛋白处理，可除去其中,3/4,的杂蛋白，而酶蛋白仍然保留在溶液中,缺点：,多价阳离子的碱性蛋白质不可再利用，且其水溶液,pH23,，要小心调中性后才能应用,2.,凝集素,目前研究得比较清楚的是植物血球凝集素，如伴刀豆蛋白，它是一种特殊的蛋白质，主要对糖蛋白糖链末端序列有特异、明显的凝集力,例：,伴刀豆蛋白,对含有,G,、甘露糖,等分子的糖蛋白能发生特异凝集沉淀作用，通过离心可把糖蛋白与一般蛋白质分离开，获得的凝集素,-,糖蛋白复合物用单糖作抑制剂即可解离,优点：,条件温和，专一性强,3.,重金属,重金属（,Pb,2+,、,Hg,2+,）也能与蛋白质沉淀，纯化,Pro,。但由于重金属易使,Pro,变性，故应用时要控制在较温和的条件下进行，并及时除去重金属,(,四,),PEG,沉淀法,此法应用较广,属于非离子型聚合物引起的,Pro,沉淀作用,;,沉淀条件温和，不易引起,Pro,变性，且沉淀较完全,如用,20%PEG-6000,或,57%PEG-400,可使,-,葡萄糖苷酶,80%,发生沉淀,（五）选择性沉淀,利用目的,Pro,与杂,Pro,在不同物理化学环境下的稳定性不同（如温度、酸碱度、有机溶剂等），用选择性沉淀法，使杂,Pro,变性沉淀，而目的,Pro,存在于溶液中或发生可逆性沉淀，从而使目的,Pro,得到纯化,例：,酵母干粉抽提液升温至,55,，,20min,后迅速冷却，离心除去热变性的,Pro,，上清液中为对热稳定的醇脱氢酶,假单胞菌培养液中加,HCl,调,pH,至,4.0,，得到碱性脂酶的沉淀,（六）结晶沉淀法,操作：,将欲结晶的物质溶解于适当溶剂中，加入适量的盐,（如,20,40%,（,NH,4,）,2,SO,4,）或有机溶剂（如,EtOH,、,MeOH,等），使其溶解度降低至接近饱和的临界浓度或刚刚开始出现沉淀,调节,pH,至等电点附近，控制温度,4,左右，使溶解度进一步降低,放置一段时间（陈化），即可得到结晶沉淀,对于难结晶的物质，有时采用加入少量“晶种”引子，或进行适当搅拌，或在容器 壁上用玻棒磨檫等方法，可加速结晶,三