无菌药品生产验证课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,无菌药品生产验证中的有关问题讨论,杭州澳亚生物技术有限公司 徐全华,电话：86913427、,邮箱：,一、干热灭菌的基础理论,1、干热灭菌热穿透性指标F,H,值的概念及计算公式,1.1 F,H,值概念： F,H,是干热灭菌的杀菌热力强度，系参照基准温度T,0,=170 下的干燥灭菌时间得出，以分钟(min)来表示 。,1.2 计算公式：,F,H,=t,10,（T,1,-T,0,）/Z,式中：T,1,-每个时间点实测温度；,T,0,-灭菌保证温度（基准温度），取170。,Z-温度变化升高的灭菌率。如果以去热原为目的，Z值取,54；如果以灭菌为目的，Z值取20；,t-灭菌时间，以分钟来计算。如果每半分钟取一个数据，则,t为0.5；如果5秒钟取一个数据，则t为1/12，代表每,个时间段F,H,值的累加值。,2.中国药典2005年版二部附录灭菌法中“干热灭菌法”的要求以及F,H,值的计算,本法系指将物品置于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中，利用干热空气,达到杀灭微生物或消除热原物质的方法。,不同灭菌程序的F,H,值,程序,F,H,杀菌值,F,H,灭内毒素值,温度,时间,计算值,效率,计算值,效率,160 ,120min,37.9,0.008,78.3,5.7,170 ,120.0,0.03,120.0,8.8,170 ,60min,60.0,0.013,60.0,4.4,180 ,189.7,0.04,91.9,6.7,250 ,45min,4.510,5,100,1363.6,100,也可采用其它灭菌程序,根据温度和时间计算,3、干热灭菌F,H,值的标准,（1）对于不直接接触药品的不锈钢器具（如冻干托盘、框,架或胶塞桶等）,应从灭菌的角度考虑，最低,要求为：,F,H,37.9,最高要求F,H, 189.7，从灭菌的风险性考虑应选择,F,H, 189.7。我们对这些物品的灭菌采用250,30min的灭,菌程序，计算所得的,F,H,= 3.0,10,5,。,（2）对于直接接触药品的内包材（如玻璃瓶），应从杀内,毒素的角度考虑，F,H,1363。,在一定温度下达到FH值1363所需要的时间,温度（）,时间（min）,280,12.5,285,10.1,290,8.2,295,6.6,300,5.3,305,4.3,310,3.5,315,2.8,320,2.3,325,1.8,330,1.5,4.中国药典附录 灭菌法中“干热灭菌法”对细菌内毒素挑战试验的要求,干热灭菌法,细菌内毒素灭活验证试验是证明除热原过程有效,性的试验。一般将,不小于1000单位的细菌内毒素,加,入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能,使内毒,素至少下降3个对数单位,。细菌内毒素灭活验证试验,所用的细菌内毒素一般为大肠埃希菌内毒素(Escherichia coli endoxin）。,5.美国药典附录灭菌法及无菌保证 “干热灭菌法”对细菌内毒素挑战试验的要求,Dry-Heat Sterilization,干热灭菌法,The test with,Limulus,lysate could be used to demonstrate that the endotoxic substance has been inactivated to not more than,1/1000,of the original amount (3log cycle reduction).,用鲎试剂检测法可证实细菌内毒素含量失活不少于1/1000（3个对数单位) 。,6.英国药典附录 灭菌法 “干热灭菌法”对细菌内毒素挑战试验的要求,Dry heat sterilisation,干热灭菌法,Dry heat at temperatures greater than 220C is frequently used for sterilisation and depyrogenation of glassware。 In this case demonstration of a,3-log,reduction in heat resistant endotoxin can be used as a replacement for biological indicators,干热温度高于220常被用于玻璃器具的灭菌和除热源。在这种情况下，证实细菌内毒素下降3个对数单位，可用于代替生物指示剂试验。,6、Excel在FH值计算中的应用,（1）每个时间点的FH值计算公式：,F,H,=POWER(10,(C3)-170)/54)SECOND(B3- B2)/60,power代表以10为底的幂 ； C,3,代表第2次记录时的温度； 170 代表灭菌保证温度；,54 代表去热原的工值； SECOND 代表秒； B,3,代表第二次记录的时间；,B,2, 代表第一次记录的时间；60 秒转换成分钟。,次数(A)时间(B) 通道1 (C),通道2 (C),温度 FH值,温度 FH值,1 2007-03-28 09:36:22 120 0.0,94 0.0,2 2007-03-28 09:36:27 139 0.0,94 0.0,3 2007-03-28 09:36:32 139 0.0 111 0.0,4 2007-03-28 09:36:37 161 0.1 133 0.0,5 2007-03-28 09:36:42 181 0.1 155 0.0,6 2007-03-28 09:36:47 199 0.3 175 0.1,7 2007-03-28 09:36:52 214 0.5 195 0.2 ,8 2007-03-28 09:36:57 226 0.9 211 0.5,9 2007-03-28 09:37:02 237 1.5 225 0.9,10 2007-03-28 09:37:07 246 2.1 236 1.4,11 2007-03-28 09:37:12 253 2.9 246 2.1,12 2007-03-28 09:37:17 260 3.9 254 3.0,13 2007-03-28 09:37:22 266 5.0 260 3.9,14 2007-03-28 09:37:27 267 5.2 267 5.2,（2）总的F,H,值在Excel的求和功能中得到。,二、灭菌隧道烘箱的验证,1、灭菌隧道烘箱的基本情况,1.1功能作用：,玻璃管制注射剂瓶的干热灭菌和除热原.。,1.2结构：,由预热段、灭菌段、冷却段三部分组成。通过远红外加热管产生的热风空气由耐高温过滤器进行过滤后对玻璃瓶进行灭菌。玻瓶通过转动的网带走过三个段。,1.3程序设定考虑的因素：,(1)网带速度：直接影响玻璃在隧道中的运行时间,应该以企业确定的最大生产能力确定网带运行速度。,(2) 温度：在速度确定的情况下，设定加热管温度（通常为360）和灭菌温度（330 ）,2、验证温度探头的布点图,方式一：,方式二：,方式三：,隧道运动方向,隧道运动方向,隧道运动方向,3、空载热分布试验,USP30：STERILIZATION AND STERILITY ASSURANCE OF COMPENDIAL ARTICLES“Dry-Heat Sterilization ”,可接受标准依据：,美国药典30版：灭菌法及无菌保证。,A typical acceptable range in temperature in the empty chamber is 15 when the unit is operating at not less than 250。,当设备温度不小于250时，在空腔中典型的温度可接受范围为15 。,（1）操作方法：将10支铂电阻探头按方式（三）布点后固定在网带上方的打孔搁板上，按SOP进行预热，待达到控制温度后，开动网带，探头随不锈钢网带进入预热段、灭菌段、冷却段，程序结束，停止试验。,（2）测试次数：3次,（3）可接受标准：平均温度250以上时，热分布温差 15。,（4）统计计算：应统计10个探头同一时间点的温度平均值，并计算平均值与最大值和最小值之间的极差。,4.空载热分布试验的经验体会,（1）热分布的铂探头应予固定，不能与网带、搁板、或玻瓶接触，,否则会造成短路，数据不准确，试验失败。,（2）热穿透试验的FH值约为空载热分布的2/3（经验值），热穿透,试验的FH值可接受标准为：大于1363min（一般设计在1800min以,上），因此，尽管空载热分布研究温度分布均匀性，也必须进行FH值,的计算，最好在2700min以上，以保证热穿透的FH值。,（3）由于灭菌隧道烘箱运行不正常，造成温度探头在隧道的滞留，,FH值的不正常累加，应认为试验失败，应重新试验。,（4）偶然的少数数据缺失，可以按统计学的要求进行缺失数据的弥,补。,(5)由于温度探头与记录仪之间的导线很长，为了保证检测温度的,准确性，温度探头应该采用三线制的接法，而不应该采用二线制接法。,5、满载热分布和热穿透试验,满载热分布和热穿透试验可同时进行。,4.1操作方法：,同空载热分布。但温度探头必须插入玻瓶的内部，但又,不能接触瓶壁。,4.2测定次数：,3次,4.3可接受标准：,(1)热分布温差：15。,依据：由于满载和热穿透条件下，热空气对流受阻的原因，温度均匀性,较空载时差，制订与空载相同的标准应该说要求更严格。,（2）F,H,1365min。,依据：,a.中国药典2005年版二部干热灭菌法的除热原程序250 45min计算,所得。,b.国家发展改革委员会于2007-03-06发布了JB/T20093-200）抗生素瓶,表冷式隧道灭菌干燥机的制药机械行业标准，要求于2007-09-01实施。在,标准中：5、要求：灭菌性能：b）热穿透性F,H,1365min。,6、温度无纸记录仪（整体图）,生产厂家：北京金立石自动化仪表厂,温度无纸记录仪（正面图）,温度无纸记录仪（背面图）,6、细菌内毒素挑战试验,6.1内毒素指示剂布点方法,按如下方法进行布点：,预热段,冷却段,灭菌段,1,2,3,4,5,6.2内毒素指示剂使用方法,除去细菌内毒素指示剂标签，折断易折安瓿瓶颈，用铝箔封闭瓶口，将内毒素指示剂按上述布点方法布置，经过一个干热程序后测定残余内毒素量。,6.3残余细菌内毒素的检测,内毒素指示剂的标定：将未经干热的内毒素指示剂加1.0ml细菌内毒素检查用水，置于漩涡混合器上混合15min，10倍稀释至接近所选用的鲎试剂灵敏度，再2倍梯度稀释成4、2、1、0.5、0.25的内毒素系列溶液，根据反应终点的稀释倍数计算可回收内毒素量。,未经干热的内毒素稀释系列(如2500EU/支),稀释倍数（D）,2500,5000,10000,20000,40000,内毒素浓度（EU/ml）,1.0,0.5,0.25,0.125,0.06,反应结果,+,+,+,-,-,可回收内毒素,Rc=D1.0ml=0.25100001.0=2500EU/瓶,将经干热的内毒素指示剂加1.0ml细菌内毒素检查用水，,置于漩涡混合器上混合15min，再作一次10倍稀释。,稀释倍数（D）,1,10,反应结果,（1） - -,（2） + +,-,-,D=1时:,残余内毒素 Rs= D1.0ml0.2511.0 0.25EU/瓶,内毒素衰减 lgRd= lgRc- lgRs lg2500- lg0.25 4,D=10时:,残余内毒素 Rs= D1.0ml0.25101.0 2.5EU/瓶,内毒素衰减 lgRd= lgRc- lgRs lg2500- lg2.5 3,6.4内毒素指示剂检测注意事项,内毒素指示剂必须与该批效价测定的鲎试剂配套使用，而不能单一,购买内毒素指示剂后与实验室其他批号的鲎试剂配套使用，因为厂家提,供的内毒素指示剂在效价测定时与相应批号的鲎试剂进行检定。如湛江,安度斯的情况：,购买的内毒素指示剂必须用配套的鲎试剂按中国药典细菌内毒,素检查法进行鲎试剂灵敏度复核试验。,高浓度的内毒素指示剂强烈地粘附在安瓿壁上，除用漩涡混合器混,合十五分钟以上外，用移液枪强烈打碎混匀。,内毒素指示剂批号及效价,相应的鲎试剂批号及灵敏度,0702090 2500EU/支,0606271 0.25EU/支,0802290 1500EU/支,0801182 0.125EU/支,6.5标准细菌内毒素指示剂与鲎试剂,生产厂家：湛江安度斯生物有限公司,湛江市人民大道中38号,7、灭菌隧道烘箱验证的体会,7.1 现有的灭菌隧道烘箱一般为洗烘灌联动线，如联动线运行不,正常造成中途停滞，应重新验证，因为中途停滞会造成FH值,的累加。,7.2 负载热分布和热穿透试验，温度探头插入玻瓶中，由于热空,气对流受影响，因些满载FH值低于空载FH，在空载热分布,试验结束时，可对FH值进行预计算，如果FH值过低，需调整灭,菌程序。,7.3 由于热电偶与温度记录仪的连接导线比较长，一般为810m(设,备长度5.5m)， 距离较长，为了消除连接导线电阻变化的影响，,热电偶接法应为三线制接接法，不应为二线制接法，否则温度测,定误差较大。,7.4热电偶在运行使用中不应与腔室内金属等接触，避免造成短路。,7.5 内毒素挑战试验可以代替生物指示剂挑战试验。,三.百级净化热风循环烘箱的验证,1.百级净化热风循环烘箱的基本情况,1.1功能：用于不锈钢桶（盛装灭菌胶塞）、冻干盘、框 架等金属物品的灭菌。,1.2结构：加热器、风机、耐高温过滤器、温度控制器及记录仪、程序计时控制器。,1.3程序设定：由于以灭菌为最终目的的干热灭菌，考虑采用中国药典干热灭菌法的灭菌程序，温度设定值应适当高于中国药典规定的灭菌温度，或者延长灭菌时间。,2、空载热分布试验,（1）布点方法：,（2) 操作方法：将10支热电偶通过验证孔插入箱体内，按上述布点方法进,行布点，其中的一支热电偶应位于设备自身控制系统的温度传感器附近，按,SOP启动灭菌程序。,（3）可接受标准：热分布温差15。,（4） 测试次数：3次。,1,2,3,5,4,7,6,8,9,10,1,2,7,8,9,3,4,1,2,7,8,9,3、负载热分布和热穿透试验,（1）操作方法：应考虑平时生产中的最大装载，把,温度探头插入灭菌物品的内部（如冻干盘上下盖相合的,中央，不锈钢桶即用桶盖盖上）。,（2）可接受标准：F,H,（按灭菌计算）190。,（3）测定次数：3次,4、生物指示剂挑战试验,4.1布点位置：每层放置4个，考虑放置在F,H,值较低的,部位。,4.2 方法：采用枯草黑色变种芽孢生物指示剂,（ATCC9372），含菌量：510,56,/片。菌片放入培养,皿中，灭菌程序结束，取出培养皿，无菌条件下将菌片,放入配套的液体培养基管中。,4.3 可接受标准：阳性对照菌片有菌生长（培养液由粉,红色变黄色）；灭菌菌片无菌生长（培养液颜色未变,化）。,5.微生物挑战性试验结果,四、湿热灭菌柜的验证,1.脉动真空压力蒸汽灭菌柜的基本情况,1.1功能：用于注射剂生产的部分辅助物料的灭菌，包括：除菌,过滤器、填充机械部件（陶瓷泵或玻璃泵）、连接胶管、工作服,装、清洁用品（洁具）。,1.2结构：真空系统、工业蒸气系统、纯蒸汽系统、压缩空气系,统。,1.3程序设定：采用饱和蒸汽-预真空程序。包括：空气去除-充,蒸汽-灭菌-抽蒸汽-干燥-真空解除六个阶段。,湿热灭菌包括两种方法：过度杀灭法（The Overkill,Method）和生物负载法/残存概率法(The Bioburden Method)。,根据湿热灭菌工艺决策树，这些物品可以采用过度杀灭,工艺，为保证一定的安全系数，我们选用122 20min工艺。,2、10支热电偶的布点方法,将灭菌腔室纵向横切3个平面- A面、B面和C面。A面,（1、2、3、4）和C面（5、6、7、8）分别靠近十万级洁,净面和无菌万级洁净面，各面的4角为灭菌车筐的顶点。B,面为灭菌车的中央，9号探头位于B切面的中心点。10号探,头位于灭菌器温度控制和记录的传感器旁。,1,2,3,4,9,5,6,7,8,A面,B面,C面,3.空载热分布,3.1操作方法：将10支温度探头通过验证孔伸入灭菌,室内，按上述布点方式进行布点，按SOP启动灭菌程序。,2.2可接受标准：保温灭菌段热分布温差1.0。,2.3测试次数：3次。,4.满载热分布,4.1操作方法：同空载热分布，考虑生产中的最大装载。,4.2可接受标准：保温灭菌段热分布温差1.5 。,4.3测试次数：3次。,5. 热穿透试验,5.1操作方法：同满载热分布，将温度探头放入灭菌物,品的中心部位。,5.2可接受标准：F,0,15 。,5.3测试次数：3次。,F,0,值的计算,有些温度验证仪软件没有F,0,值的计算功能，数据,导入Excel中，可用下列公式计算：,F,0,t10,（T,1,-121）/10,湿热灭菌温度记录仪,生产单位：浙江泽大科学仪器公司,6.生物指示剂挑战试验,7.1随热穿透试验同时进行。放置在灭菌物品内部。,上层一个点，中间层1个点，最下层3个点（其中1个放,在冷凝水排放点附近），每个点放2支指示剂。,7.2采用嗜热脂芽孢杆菌（ATCC7953）；含菌量,510,56,个/支。,7.3可接受标准：阳性对照菌瓶有菌生长（培养液由紫色变成黄色），灭菌处理菌瓶无菌生长。,生物指示剂挑战试验结果,7.湿热灭菌柜验证中的一些思考,（1）热分布试验结果往往并不是理论所说，很难找到确切的冷,点，但一般在底部排放冷凝水的地方。,（2）有些企业由于缺乏验证仪器，用生物指示剂试验代替热分,布和热穿透的温度物理测试，不符合法规及指南的要求。,a.WHO GMP1992d17.58强调：化学或生物指示剂可用于灭菌过,程的监控，但不得代替物理监控（温度、时间）。,b.FDA认为：生物指示剂验证并不能取代物理验证，这是由生物,指示剂验证的复杂性所决定的。,c.欧盟GMP附录1：无菌药品的生产第59条：Biological,indicators should be considered as an additional method for,monitoring the Sterilisation。应将生物指示剂作为灭菌监控的补充,手段。,（3）有关湿热灭菌可参考国家药监局委托中国医药设备工程协,会起草的用于最终灭菌药品（注射剂）湿热灭菌工艺及验证指南,（征求意见稿）。,五、胶塞清洗机的验证,1、胶塞清洗机的基本情况,（1）设备功能：用于药用卤化丁基橡胶塞的清洗和灭,菌。,（2）工作步骤：真空进料纯化水喷淋粗洗纯化水漂洗排放注射用水精洗硅化 排水,注射用水冲洗, 12120min蒸汽灭菌抽真空热风干燥真空干燥常压化出料。,2、,干燥程序前的最终淋洗水的检测,2.1最终淋洗水可接受标准：,（1）微生物限度10CFU/100ml；,（2）细菌内毒素0.25EU/ml；,2.2取样量：满足检测要求。,2.3 验证次数：3次,3、灭菌胶塞的无菌性验证,3.1验证方法：在出料过程中用灭菌不锈钢镊子取无菌胶,塞直接放入细菌培养基（硫乙醇酸盐液体培养基）、真菌,培养基（改良马丁培养基）中，分别在3035和,25.52.5条件下培养14天，观察。,3.2取样量：可参考中国药典无菌检查法医疗器械取样量。,3.3验证次数：3次。,胶塞无菌性试验结果,4、微生物挑战试验,检查方法:,取压力蒸汽灭菌生物指示剂3支(菌种名称:嗜热脂肪芽孢杆,菌ATCC753;生产日期:,年,月,日;批号:,;型号:F012;,含菌量510,56,cfu/支)和被灭菌的胶塞一起放入胶塞清洗机内,灭菌,后取出,直接置于5660培养48小时,并另取一支未经灭菌生物指示剂,作为阳性对照。,可接受标准:,根据颜色确定灭菌效果,培养后全部保持紫色，灭菌合,格；若有1支由紫色变为黄色判为无菌不合格。对照管应由紫色变为黄,色为该指示剂有效。,测试次数：,3次。,微生物挑战试验结果,六、臭氧灭菌柜的验证,1、臭氧灭菌柜的基本情况,1.1功能：用于铝塑组合盖的消毒。,1.2程序设定：设定消毒时间60min。,2、卫生部消毒技术规范对臭氧消毒的有关规定,2.1空气消毒：臭氧对空气中的微生物有明显的杀灭作用，采用20mg/m,3,浓度的臭氧，作用30min，对自然菌的杀灭率达到90以上。,2.2表面消毒：1）用臭氧气体消毒,臭氧对物品表面上污染的微生物有杀灭作用，但作用缓慢，一般要求60mg/m,3,，相对湿度70，作用60min,120min，才能过到消毒作用。,3、臭氧浓度测定,3.1仪器：真空采样器，气体检测管。,3.2方法：,(1)割断检测管两端封头；,(2)将检测管插在采样器进气口上；,(3)将采样器手柄拉至第2档位，前后拉一次，放入灭菌柜中，共采样100ml，进气时间23min，待检测管中指示剂变色终止，即可以从白色柱所到刻度读出数据。,Model 106便携式臭氧分析仪,技术规格,检测范围：0.001ppm100ppm,（最高可达999ppm）；,分 辨 率：0.1ppb（0.0001ppm）；,电源要求：11-14 V DC，通常在12V,时300 mA，3.6 w；,采样 流量：1升/分钟；尺 寸：10.1 x 18.8 x 21.6 cm；,重 量：1.9 kg；精 度：1.5 ppbv或2%，取大者；,准 确 性：1.5 ppbv或2%，取大者；数据 输出：可连接电脑输出。,对臭氧消毒的一些看法,1、企业普遍缺乏先进的臭氧浓度检测仪器，无法精确测定臭氧浓度。,2、我们曾对臭氧消毒采用枯草芽孢杆菌生物指示剂菌片（5105 5106 ）进行挑战试验，处理管仍为阳性，表明臭氧对芽孢的杀灭是有限的。但理论报道对金黄色葡萄球菌有较好的杀菌效果。,七、培养基模拟分装试验,1.欧盟对培养基模拟分装试验的要求（欧盟药品GMP附录无菌药品的生产第二版，2004年8月）,第42条、无菌生产工艺的验证应当包括培养基的模拟试验。1、应根据产品的剂型、培养基的选择性、澄清度,浓度和灭菌的适用性来,选择使用培养基,。2、应尽可能地,模拟常规的无菌生产工艺,并包括所有对结果有影响的关键生产工序。3、此外，还应,考虑正常生产过程已出现过的各种偏差及最差情况,。4、培养基模拟试验的,初始验证每班需要三个连续试验,。5、此模拟试验应在规定的时间间隔以及空气处理系统,设备,生产方法和班次数有重要的,变更后重复进行,。6、培养基模拟实验通常每班每个工艺每年进行两次。7、培养基灌装容器的数量要足以保证评价的有效性。对批量比较小的产品而言, 培养基灌装的数量应至少等于产品的批量。8、,培养基模拟分装试验的目标是不出现长菌，但,可信度为95%时，污染率应小于0.1%,。企业应建立警戒限度及纠偏限度。,2.欧盟对培养基模拟分装试验的要求（欧盟药品GMP附录无菌药品的生产2005年增补内容）,评估标准的变化：,第47条：培养基模拟分装试验的目标是不出现长菌，应按以下,建议,对无菌工艺进行评估：,.灌封数,低于5000时，不得检出污染,。,.灌封数在,500010000,时：,-当有,1瓶污染,时，需进行调查，并应考虑重复培养基灌封试验。,-当有,2瓶污染,时，需进行调查，并在调查后应进行再验证。,.灌封数,超过10000,时：,-当有1瓶污染时，需进行调查。,-当有2瓶污染时，需进行调查，并在调查后应进行再验证。,对失败进行全面调查的内容，应该延伸到对上一批培养基灌装试验合格后，对所生产产品无菌可能的影响因素。,从评估标准的变化看（1）强调污染的调查；（2）污染率从应,小于0.1%，,提高为,应小于,0.06%。,3、培养基模拟分装试验的关注点,3.1培养基的选择,（1）可采用3%胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB） （杭州微生物试,剂有限公司），该培养基适用于细菌和真菌的生长。,（2）应该进行培养基灵敏度试验（阳性对照试验）。,参考中国药典附录H无菌检查法培养基灵敏度试验进行。,方法：取每管装量为10ml 的已灭菌胰蛋白胨大豆肉汤培养基20支，,10支接种小于100 cfu 的枯草芽孢杆菌，另10支接种小于100 cfu 的白,色念珠菌，按模拟分装试验的培养条件进行培养，逐日观察结果。,结果判定 ：至少有50%以上接种的试管培养基出现明显的微生物生,长，判该培养基的灵敏度检查符合规定。,3、培养基模拟分装试验的关注点,3.2制订培养基模拟分装试验应考虑的因素：尽可能模拟平时实际的生,产工艺。,（1）由于活性炭对培养基营养成分的吸附，以及金属钛棒对含蛋白类,物质难以过滤的原因，工艺中可不必进行活性炭吸附和钛棒脱炭处理。,（2）配制的培养基温度以45 50为宜，过低的温度导致粘度过,大，很难进行除菌过滤。,（3）培养基的灌装体积应至少空瓶体积的1/3。,（4）配制液和除菌过滤液均应取样，便于和阳性样品进行微生物比对,调查。,（5）由于模拟分装试验的数量有限，灌装时间会很短，通过间隙停顿,的方法拉长灌装时间，与实际生产时间相似。但应该避免由于停顿造成玻,瓶在灭菌隧道烘箱内停留。,（6）要模拟最差条件，最好在环境大消毒之前进行。,（7）灌装后的样品在进行培养的时候，需要进行一次倒置，然后再正,立，这样的目的是为了让培养基充分接触瓶子的内表面，保证培养基与所,有可能接触到的内包装材料，包括瓶底、瓶壁、瓶口及胶塞部分充分接,触，能够正确的反应微生物的污染情况，避免假阴性的现象。,3、培养基模拟分装试验的关注点,3.3培养基模拟分装试验的周期：,（1）新工厂系统初期验证需要3个连续试验。,(2)在没有变更的情况下，每年2次。,（3）空调净化系统、设备、工艺、生产班次数、生产线,配置的变动、人员重要变动、环境监控结果异常、无菌检,查结果阳性等，如果通过评估认为此项变更会影响到无菌,生产工艺产品的无菌保证水平，则需要进行增补性培养基,灌封试验。,3、培养基模拟分装试验的关注点,3.4培养基模拟分装的数量,（1）样本量：n3000瓶。,（2）按欧盟GMP附录1：无菌药品的生产,（2005增补内容），样本量： n5000瓶。,3、培养基模拟分装试验的关注点,3.5培养温度和时间、观察频率,（1）20 25培养7天，再在 30 35培养7,天；或者： 30 35 培养7天，再在 20 25培,养7天。,（2）第3天、第7天和第14天各观察1次。目的是早期的观察有利于污染状况的分析。,3、培养基模拟分装试验的关注点,3.6合格标准,（1）可信限为95%时，污染率0.1%。,（2）按欧盟GMP附录1：无菌药品的生产（2005增补,内容），可信限为95%时，污染率0.06% 。,（3）药品生产验证指南2003年版P259页表4-3：,可信限为95%时一次模拟分装中模拟分装量、污染数量与,污染概率关系表。,模拟分装,数量,污染数量,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,3000,0.0998,0.1581,4750,0.0998,0.1325,6300,0.0999,0.1230,7760,0.0999,0.1179,9160,0.0999,0.1147,10520,0.0999,0.1125,11850,0.0999,0.1109,13150,0.0999,0.1097,14440,0.0999,0.1087,15710,0.0999,0.1079,16970,0.0999,0.1072,污染概率0.1%,二项分布（binomial distribution）的概率函数,（1）什么是二项分布？,假设有一随机试验，每次试验多有两种不同的结果，如培养基模拟分装试验中对于每一个灌装的瓶子要么有菌，要么无菌，这二种可能的结果是互不相容的。独立地将此试验重复n次（譬如：培养基模拟分装量n ），求在n次中出现一种结果（譬如：出现染菌情况）x次的概率是多少？这种概率分布事件称为二项分布。,(2)二项分布的展开式,（q+p）,n,=q,n,+nq,(n-1),p,1,+,n(n-1)/2!,q,(n-2),p,2,+,n(n-1)(n-2)/3!,q,(n-3),p,3,+ +,n(n-1)(n-2),(n-x+1),/x!,q,(n-x),p,x,+p,n,其中：（q+p）=1,(3)二项分布的概率函数,从二项分布展开式，可以推出如下概率函数：,p（x）C,x,n,p,x,q,(n-x),=,n(n-1)(n-2),(n-x+1),/x!,p,x,q,(n-x), x=1,2,3,-n.,其中：p（x）-发生A事件（染菌事件）x次的概率函数；,C,x,n,-在n次试验中出现A事件（染菌事件） x次的组合数；,p-事件A发生的概率（如培养基模拟分装试验允许的污染概率为0.1%）；,q-与事件A互不相容的事件发生的概率 如培养基模拟分装试验允许的不污染概率为(1- 0.1%) =99.9% ；,n-样本含量（灌装数量）；,x-在n次试验中，事件A （染菌事件）出现的次数。,当培养基模拟分装量超过16970支时，企业如何计算允许污染数量（支数）？,举例：当模拟分装数量为21000支时，允许污染的瓶数为多少（采用试算法）？,(1)当有14瓶污染时：,p(x)= 21000! (10,-3,),14,(110,-3,),(21000-14 ),=0.0282,14！(2100014)！,(2)当有15瓶污染时：,p(x)= 21000! (10,-3,),15,(110,-3,),(21000-15 ),=0.0395,15！(2100015)！,(3)当有16瓶污染时：,p(x)= 21000! (10,-3,),16,(110,-3,),(21000-16 ),=0.0518,16！(2100016)！,p(x)控制在0.05。,4、微生物污染的调查,4.1FDA检查员指导手册CP7356.002A无菌药品工艺检查,对微生物污染调查的要求。,268. Are microorganisms from positive vials identified,according togenus?第268条：阳性样品瓶内的微生物鉴别出其,属了吗？,269. Are such microorganisms correlated to those found,duringenvironmental monitoring?第269条：这些微生物与环境,监测中发现的有关系吗？,4.2微生物种属的鉴别必须借助于全自动微生物鉴定系统。,污染样品,污染样品的微生物分离（配制液）,污染样品的微生物分离（阳性样品）,法国生物梅里埃公司VITEK,2微生物鉴定系统,4、微生物污染的调查,4.3调查实例：,通过眼力健（杭州）有限公司的Vitek鉴别系统对阳性培,养瓶内的微生物进行了种的鉴别，鉴别结论为：,虎红平板上生长的菌落和管制瓶内溶液分别进行了菌落,的分离纯化，将它们分别接种于TSA（营养琼脂）、SDA,（虎红琼脂）和R2A（水系统监测专用培养基）上，结果,全部都有相同菌落生长，经Vitek鉴别为：Rolstonia,pickettii（罗尔斯顿皮氏假单胞菌），该菌为G-杆菌，需氧,、不形成芽胞，直或弯曲，长1-5um，宽0.5-1um，氧化酶,通常阳性。该菌是水中常见菌（水生菌），非致病菌。,八、洁净区甲醛消毒的微生物挑战试验,1、中国药典2005年版附录 灭菌法中有关甲醛灭菌的要求,气体灭菌法,本法系指用化学消毒剂形成的气体杀灭微生,物的方法。常用的化学消毒剂有环氧乙烷、气,态过氧化氢、甲醛、臭氧（O3）等。,挑战用生物指示剂一般采用枯草芽孢杆菌孢,子（spores of Bacillus subtilis)。,甲醛气体常用于环境的熏蒸消毒。,2.甲醛熏蒸系统的结构示意图,胶塞存放间,压缩空气,灌装间（4）,灌装间（3）,灌装间（2）,灌装间（1）,走廊,3、喷雾头,4、甲醛熏蒸系统的结构与工作原理,4.1结构：,该系统安装在无菌万级区域功能间中，由,压缩空气管道,和,不锈钢雾,化喷头,及,装有甲醛的喷壶,组成，由压缩空气总阀控制压缩空气的流,量，利用压缩空气通过喷头时使甲醛雾化，进行空间环境的消毒和灭,菌，消毒后在排风机箱处排放。,4.2甲醛雾化工作原理,在,相对湿度65%以上、温度3040,条件下，甲醛气体的消毒效果,最好。因此采用雾化的方式，使甲醛由液体变成细小的微粒，均匀地,分散在空气中，和热空气充分地混合，进入到无菌万级的各个角落及,缝隙中，在空间密闭4小时以上以达到彻底消毒和灭菌的目的。,5、操作方法,3.1利用空调系统加热和加湿装置对洁净室进行加温和加,湿，,温度达到3040之间，湿度达到65%以上。,3.2计算每个灭菌点的,房间体积,，并按,10ml/m,3,的浓度将,36%的甲醛溶液倒入喷壶中，并与雾化喷头相旋接。,3.3在无菌万级各功能房间中放入直径9cm经1702小时,灭菌的玻璃培养皿，并,放入枯草黑色变种芽孢生物指示剂,（菌片），每室放置2点，每点2片。,3.3打开压缩空气控制阀门，调整压缩空气的流量,将雾,化的甲醛在高温高湿的环境中形成甲醛气体,喷雾时间以喷,完为准，,房间密闭时间4h，,然后开启空调系统，同时打开,新风口和排风口，开启排风系统，采用新鲜空气进行置,换，,排放时间大于8小时,。,5、操作方法,3.4气体灭菌结束后，检测人员穿好已灭菌的无,菌工作服进入洁净区，将所有的培养皿盖合上，做,好标记。,3.5在洁净室的微生物限度检查室中，用已灭菌,的镊子夹取培养皿中的菌片放入枯草黑色变种芽孢,培养液中密闭培养，,3748小时培养观察。另取,一支未经甲醛气体灭菌的菌片作阳性对照。,6、灭菌效果,7、验证用生物指示剂的来源,生物指示剂名称：,枯草黑色变种芽孢生物指示剂（ATCC9372）,上海鸿雍生物科技有限公司,上海斜士路716号3号楼507室,电话：021-63034135 传真：63047015,邮编：200023,菌含量的标定问题。,九、验证主计划问题,1、药品GMP检查评定标准对验证主计划的规定的变化,235条,259条,*5701企业是否进行药品生产验证，是否根据验证对象建立验证小组，提出验证项目，制订验证方案，并组织实施。,*5701,企业应有验证总计划,，进行药品生产验证，应根据验证对象建立验证小组，提出验证方案，并组织实施。(,增加应有验证总计划,),2、什么是验证总计划？,A Validation Master Plan (VMP) is a comprehensive document describing the applicable validation requirements for the facility and/or process, and providing a plan for meeting those requirements.,验证主计划是一个,对于设施和/或工艺描述适宜的验证要求的详细文件,并且,提供一个计划来满足这些要求,。,3.验证主计划应描述什么内容？,WHO在2003年发布“,SUPPLEMENTARY GUIDELINES ON,GOOD,MANUFACTURING PRACTICES (GMP):VALIDATION,”（药品生产质量管理规范补,充指南：验证）指南框架如下：,CONTENTS,目录,10,、,Validation Report (VR),10、验证报告,1,、,Introduction,1、引言,11,、,Relationship between validation and qualification,11、验证和确认的关系,2,、,Glossary,2、术语,12,、,Qualification stages,12、确认的阶段,3,、,Scope of document,3、文件的范围,13,、,Process validation,13、工艺验证,4,、,Validation,4、验证,14,、,Computer validation,14、计算机验证,5Qualification,5、确认,15,、,Analytical validation,15、分析方法验证,6,、,Calibration and verification,6、校正和检定,16,、,Cleaning validation,16、清洁验证,7,、,Validation team,7、验证组织机构,17,、,Re-validation,17、再验证,8,、,Validation Master Plan (VMP),8、验证主计划,18,、,Change control,18、变更控制,9,、,Validation Protocol (VP),9、验证方案,19,、,Personnel,19、人员要求,该指南第8项VALIDATION MASTER PLAN8.2条Specificre quirements对验证主计划的内容规定如下：,The VMP should be concise and should typically include the following：验证主计划应该简明，通常包括如下内容：,1.table of contents;,目录,puter system validation;,计算机系统验证,2.introduction, policy and objectives;,概述、验证方针和目标,15.re-validation intervals;,再验证周期,3.description of facilities, including plans;,厂房设施的描叙,，包括设,计平面图,16.new process cycles validation;,新工艺周期验证,4.constitution of the validation committee;,验证委员会的组织机构,17.reasonable unexpected events (worst case), e.g. power failure, computer crash and recovery, filter integrity test failure;,合理的非预期事件（最差条,件），比如停电、计算机崩溃和,恢复，滤器完整性测试失败等。,5.glossary of terms;,名词解释,1,8.key acceptance criteria;,接受标准,6.description and history of equipment;,设备的描叙及历史,19.documentation format to ensure a systematic approach to the layout and format of these documents, e.g. training record, raw data retention record, calibration record, validation protocol, validation report, etc.;,文档格式化,，用系统的方法确保,文档规范化/格式化，比如培训记录、原始数据记录、校正记录、验证方案、验证报告等。,7.description and listing of protocols;,验证方案的说明及清单列,表,20.list of relevant SOPs (how?);,列出相关SOP（如何做）,8.preventative maintenance programme;,预防性维护程序,21.planning and scheduling (when?);,计划和时间表（什么时候做）,9.personnel training programme;,人员培训程序,22.location where the validation activity is to,be performed (where?);,指定在什么地方实施验证,10.process and cleaning validation;,工艺和清洁验证,23.estimate of staffing requirements to,complete the validation effort described in the,plan (who?);,评估参与验证的人员,11.laboratory instrument qualification;,实验室仪器确认,24.time plan for the project, showing detailed,planning of sub-projects (when?);,项目开展时间,，细化到子项目,12.analytical method validation;,分析方法验证,25.change control identifying the companys,commitment to controlling critical changes; and,当控制标准发生变化时的变更控,制,13.facility/utility qualification;,厂房设施、公用工程确认,26.approvals.,批准,4、适合于国内企业的新厂房设施、新建生产车间的验证主计划目录举例,一、引言,二、公司及工厂概况,1.公司基本情况（成立日期，从事哪类产品的研制、开发和商业化生产、总占地面积、建筑面积等）；,2.公司产品情况；,3.项目和生产区域概述；,3.1厂房设施及公用工程系统说明；,3.2人流和物流说明；,3.3生产和检验设备说明；,3.4工艺流程介绍。,三、验证主计划目的,四、验证主计划范围,五、公司标准(法规标准的引用),六、验证组织机构及职责,七、验证项目及方法,1、厂房设施；2.设备；3.工艺；4.清洁；5.再验证。列出验证项目清单。,八、可接受标准,九、标准操作程序（待起草和审批的程序）,包括：生产、质量保证、质量检验、设备操作、清洁等。,十、人员培训,十一、时间进度和人力安排,十二、变更控制,附录,1、公司组织机构图；,2.公司总平面布置图；,3.工艺流程图；,4.空调净化系统送风、回风、排风图；,5.纯化水、注射用水系统图；,6.压缩空气系统图；,7.氮气系统图；,8.设备平面布置图。,5、在完成新厂房、生产车间的验证主计划后，必须制订年度验证主计划,目录举例：,1 前言,2 再验证目的,3 再验证范围,4 引用标准,5 再验证组织机构,6 再验证工作程序,7 再验证工作基本要求,8再验证项目及时间安排,9 需要形成的验证文件,10 验证分类及代号分类,十、环境监测用营养琼脂培养基制备与使用的操作问题,1、多数企业的工作流程,流程：,1.1配制灭菌和贮存:, 配制营养琼脂培养基; 灌入500ml大输液瓶中; 加胶塞，轧铝,盖; 湿热灭菌; 2 10低温冰箱贮存。,1.2倾注