组化和免疫组化染色结果的定量测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十四章.组化和免疫组化染色结果的定量测定,(The Quantitation Assay of Histochemistry&Immunohistochemistry Staining),将组化,免疫组化和原位杂交等的染色结果分析提高到定量水平.最常用的有图像分析术(Image analysis technique),显微分光光度术(Microspectrophotometry technique),流式细胞术,(Technique of flow cytometry,FCM)和 激光扫描共聚焦显微镜术(Technique of laser scanning confocal microscopy,LSCM)等.,1,I.图像分析术,A.目测半定量:,依据反应产物的面积和颜色深浅,主观性大,.,B.图像分析仪(Image analyzer):,又称图像分析系统.,1.主要结构和工作原理:,a.显微镜:,获取染色结果的光学信息.,b.图像输入装置:,摄像机或扫描器,将光学信息输入电脑.,c.电脑:,将光学信息转换成电子信息.将光学信号的,灰度,分为256级可发现染色深浅的微小差别.彩色有两种:,真彩色,(Real color)是指标本染色的真实颜色,而,假彩色,(Pseudo color)是指将不同灰度转换成不同的颜色以增强对比度.,d.输出装置:,显示器或打印机等给出图象,表面几何形状,测量(体积/面积/表面积/长度等)和,图象密度,测量(数目)等客观数据.,2,2.应用:,定量给出组织细胞形态的几何参数和组织结构(包括宏观和微观)的特征性参数,从平面测量推算到空间参数和组织结构的三维图像重建.,3.注意事项:,a.,照片高质量高倍.对照组照片的放大倍数应相同.,b.,复染会影响灰度值的准确性.,c.,必要时要进行图像的加工处理,如阳性区选择和图像切割等.,3,左侧,睾丸和附睾体部精子结合抗原蛋白异构体 11(SPAG11E)免疫组化染色,.西安交通大学医学院解剖与组胚专业博士生田宏.2010.,左侧睾丸,:A.左侧假手术对,照组,;B.精索静脉曲张(ELV)2周组,周,;C.ELV4,周,.,附睾体部,:D.左侧假手术对,照组,;E.ELV2,周,;F.ELV4,周,.,4,ELV大鼠睾丸和附睾SPAG11E免疫组化灰度值测定结果:,睾丸:ELV 2周和4周组SPAG11E蛋白的平均灰度值与其相应的对照组比较未见明显改变(P0.05);,附睾:ELV2周和 4周组SPAG11E蛋白的表达均较同期对照组显著减弱(P0.05或P0.01),ELV4周组附睾SPAG11E蛋白的表达较ELV2周组显著减弱(P0.01).,5,II.显微分光光度术,A.简介:,细胞分光光度计(cytospectrophotometer),是一种以物质分子,对光波的选择性吸收,为基础,对生物样品中的,化学物质,进行定量测定的精密仪器.通过测定核酸,蛋白质,脂类,酶类或其它化学成分的光吸收和微区面积而计算它们的相对含量.,B.主要结构和工作原理:,1.光源:,有白炽灯和汞灯,疝灯.白炽灯可作为标准光源,辐射光谱在400700nm间,用于一般测量.汞灯为激发荧光的理想光源,疝灯的辐射光谱在2501100nm间.,2.单色器和滤光片:,保证进入显微镜的光波亮度充足,波长单一且可调,.,3.光电组合件:,将测量区内的光学信号转变为电子信号,产生测量数据.,6,C.基本步骤:,1.标本制备:,凡是显示细胞内化学物质的各种组化和免疫组化染色标本均可用显微分光光度计对单个细胞进行定量测定,但标本内不能有双重染色且染色要保持均匀一致.,7,2.测量方法:,a.单波长法:,用一种波长的光测量,所测物质分布如果是均匀的,因此测量法所得数值,其误差就小.,b.扫描测量法:,能够消除由于吸光物质分布不均匀而造成的分布误差,和由于面积不规则造成的面积测量误差.扫描法的原理是,通过积分,的方法,虽然被测物质分布不均匀,但可以将被测物质的面积分成许多小区,将各个小区的数值相加.,c.荧光光度法:,凡被测物质能产生荧光(原发荧光,诱发荧光,荧光或免疫荧光标记)的都可以应用荧光光度法测定.广泛用于测定细胞内的核酸(DNA和RNA),氨基酸,蛋白质,糖原,生物胺,抗体和酶的相对含量.,D.应用范围:,对细胞的DNA,RNA,蛋白质,酶,糖,脂等大分子物质以及免疫活性物质等都能定性,定位和定量测定.,8,III.流式细胞术,A.简介:,可对单个细胞逐个地进行高速准确的定量分析和分类,每秒测定达数千万个细胞,且有高度的重复性.在单个细胞中,可同时测得DNA,RNA及细胞体积3个参数,也可测定核与细胞的比例,蛋白质和免疫标记的其它参量.,B.主要结构和工作原理:,1.液流系统:,先制备,荧光等染色的单细胞悬液,放入样品管中,使其在气体压力下进入流动室;流动室内充满鞘液,在鞘液的约束下,细胞排列成,单行,由流动室的喷嘴喷出,成为细胞柱液,依次恒速通过测量区.,2.激发光器件:,在,测量区内,发射波长可调的激光柱,垂直照射细胞液柱,细胞受激光照射后发生散射光和荧光.,9,3.信号检测系统:,测定细胞发出荧光的角度,波长和大小,可知细胞的体积和细胞内某种物质的含量.,4.控制系统:,校准调节上述系统.,10,C.样品染色:,绝大多数用,荧光染料,进行标记.,1.DNA含量:,溴化乙啶(EB)和碘化丙啶(PI)嵌插入DNA的双螺旋;神光霉素与G-C有特异性;Hoechst33258与A-T有特异性;吖啶橙(Acridine orange,AO)可以同时染色DNA和RNA.,2.细胞核:,DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)是专与细胞核结合的荧光素.,3.蛋白质含量:,一般用异硫氰酸荧光素(FITC).,4.外周T,B和单核细胞以及T细胞的亚群分选:,结合特异性单克隆抗体.,11,D.应用举例:,1.肿瘤学(Oncology):,绝大多数肿瘤从空间与时间上都显示出稳定的多倍体DNA含量,而且常常是非整倍体数.FCM能诊断异常的DNA干系,可作为指导肿瘤的治疗,了解病情发展,判断预后和肿瘤治疗药物筛选等的有力证据.,2.细胞凋亡(Apoptosis):,细胞凋亡是细胞,程序性,死亡,其特征是染色体断裂和DNA片段化,凝胶电泳呈现梯状条带;细胞皱缩,致密并迅速破碎形成凋亡小体,而被邻近细胞所吞噬.细胞凋亡时需要,继续合成,DNA,蛋白质和ATP.FCM检测分析可见DNA G,0,/G,1,峰前出现一个,亚二倍体峰,(又称亚G,1,峰),代表细胞凋亡,该峰下的面积即是凋亡细胞的相对数量,可由FCM自动给出.,12,FCM检测HL-60细胞凋亡.西安交通大学医学院人体解剖与组胚专业博士生杜宝玲,2005.A图中可见明显的亚G,1,峰(25.9%),提示细胞凋亡.,B图和C图显示两种Caspase-3反义寡核苷酸转染干扰后,亚G,1,峰消失.,13,IV.激光扫描共聚焦显微镜术,A.简介:,以激光和计算机技术为基础把普通LM和,荧光LM,功能相结合,用激光扫描进行“,光学切片,”,显微镜进行微观检测,计算机对资料高速实时存储和分析,将形态学的,定量观察,生理学的动态检测,和,生物化学的定量分析,融为一体,从而使对被检物体的表面,单层,静态,局部的观察进展到立体,断层扫描,动态,全面的观察.,14,B.特点:,1.分辨率高:,LSCM以激光为光源,观察标本的反差明显,最小可观察厚度为0.5,m.,2.灵敏度高:,采用光电倍增管来检测荧光,并利用不同的滤片可将不同的光分开.,3.扫描速度快:,可达,微秒级,.因此可动态观察细胞内化学成分如Ca,2+,Mg,2+,和pH值的变化,也可对膜电位,膜的流动性等进行测定.,4.光学切片与细胞CT:,将样品各深度的切片叠加在一起进行三维重组,观察不同断面中细胞成分的变化,即“细胞CT”.,5.图像存取方便:,计算机可快速及时保存图像,其数据存取方便,可随时调用.,15,C.功能:,1.静态观察:,a.,单染色样品的观察和分析:,可对一种荧光标记的样品进行观察和分析,获得细胞平均荧光强度,积分荧光强度,细胞的周长,截面积和形态因子等参数.,b.,双染色样品的观察和分析:,可将同一部位的不同扫描图像叠加起来,用于双染,三染甚至四染样品,但需注意各种荧光染料的激发和发射波长,互不干扰,.,c.自动图像扫描观察分析:,用于一个平皿中多个散在并可能同时发生变化的细胞的同时观察.,d.荧光强度的定量测定:,用于高灵敏度快速的免疫荧光测定,以准确地监测抗原表达,细胞结合和杀伤及定量的形态学特性.,16,2.动态观察:,a.细胞内各种离子浓度的测定:,用于动态观察一段时间内细胞内Ca,2+,Mg,2+,pH值的变化并可进行定量测定.其点扫描,线扫描和图像扫描可分别观察微秒级和毫秒级的快速变化.,b.细胞膜流动性测定:,细胞膜荧光探针受到极化光线激发后,其发射光的极性依赖于荧光分子的旋转,而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性.,17,3.生物活性物质笼锁(Caged)和解笼锁(Uncaged)的测定:,笼锁化合物与生物活性物质(如第二信使,核苷酸,神经递质,Ca,2+,等)结合可抑制后者的活性,使其处于笼锁状态.当用LSCM强度和时间可人为控制的特异性波长的光,瞬间,照射后,光活化解笼锁,使该活性物质释放,其直接在光解部位发挥的作用为LSCM所检测.,4.贴壁细胞的分选:,用高能量激光杀灭不需要的细胞(荧光标记),留下需要的活细胞继续培养.,18,5.荧光光漂白恢复(Fluorescence recovery after photobleach,FRAP):,用来测定活细胞的动力学参数.FRAP借助高强度脉冲激光来照射细胞某一区域,造成该区域荧光分子的光粹灭,该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散,这个扩散速率可通过LSCM探测,得到分子运动和胞间通讯等动力学参数.,6.激光光陷阱技术:,即光摄技术,广泛应用于染色体移动,细胞器移动,细胞骨架弹性测量,细胞周期和调控研究及分子动力原研究等.利用光学梯度力形成的光陷阱,产生具有,传统机械挟持,和操纵微小物体的功能.当微米级颗粒落入一个非均匀光场中,它将趋于特定的平衡位置,物体不会偏离光学中心,造成一个势能较低的陷阱区域,这种固定是光子动量的结果,与照明强度和波长有关.,19,Overlapping distributions of corticothalamic(皮质丘脑)and(丘脑皮层)thalamocortical pathways.Early postnatal mouse.,GABA-containing terminals(red)in close apposition to oxytocin neurons(green).Rat hypothalamus.,20,V.显微照相与白平衡,A.绝对黑体:,物体对电磁波具有吸收,透过,反射三种作用,分别以吸收率,透过率,反射率衡量,此三者相加等于1.,吸收率为1,而其它两项为0的物体称,绝对黑体,.透过率为1的叫绝对透明体.反射率为1,表面光滑的叫镜体,不光滑的叫白体.这几种物质在现实中是不存在的,是理想的情况.,B.色温:,1.概念:,是表示光源光谱质量最通用的指标,按绝对黑体来定义,单位为K.光源的辐射在可见区和绝对黑体的辐射,完全相同时,黑体的温度就称此光源的,色温,.光线的色温是相当于黑体散发出同样颜色时所受到的“温度”.,21,2.色温的相对性:,色温是物理学,生理学与心理学的综合复杂因素的一种感觉,因人而异.黑眼睛的人看9300K是白色的,因此摄影照相的色温以9300K为基准,但是蓝眼睛的人看了就是偏蓝.6500K蓝眼睛的人看了是白色,黑眼睛看了就是偏黄.,色温图,22,C.白平衡与显微照相:,1.白平衡(White balance):,