实验三植物染色体畸变的观察

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验三 植物染色体畸变观察,实验学时：6学时,实验类型：设计性,每组人数：4 人组,实验内容：本实验分2部分进行,1学生自行设计处理方案，用秋水仙素诱发植物产生多倍体；,2通过取材、固定、解离、孚尔根染色法制片、镜检观察；,3.找出根尖细胞中期分裂相，确定诱发成功的细胞，观察加倍根尖细胞的染色体数目。,4学生自行设计处理方案，用化学药剂或特定污染物处理洋葱或蚕豆根尖细胞，观察细胞有丝分裂时染色体畸变（微核、粘连、聚结、断裂等）。,一、实验目的,了解人工诱导植物多倍体的原理、方法及其在植物育种上的意义，并用秋水仙素诱发植物产生多倍体；,学会利用,feulgen,染色方法鉴定细胞中,DNA,分布及鉴别人工诱导后植物染色体数目的变化；为学习植物遗传育种学和从事有关农作物育种工作奠定基础。,通过观察染色体压片，找出根尖细胞中期分裂相，确定诱发成功的细胞，观察加倍根尖细胞的染色体数目。,4,学会通过检查染色体畸变情况评价环境污染的细胞遗传学简易方法。,二、实验原理,一）、,植物多倍体人工诱发原理,生物的染色体数目一般是相当稳定的，这是物种遗传稳定性的重要特征之一。遗传学上把二倍体生物的一个配子的染色体数，称为染色体组。具有两个完整染色体组的生物体或细胞称为二倍体，自然存在的生物多属于二倍体，核内多于两个染色体组的生物体则称为多倍体。其中增加的染色体组来自同一物种或者是源于染色体组加倍，称为同源多倍体。,自然界存在多倍体物种，此外可通过人工诱导产生多倍体植物。如秋水仙素、对二氯苯等都可用于诱发多倍体，其中以秋水仙素效果最好，使用最为广泛。其主要作用原理是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体不能移向两极而被阻止在分裂中期，这样细胞不能继续分裂，从而产生染色体数目加倍的核。,二）、孚尔根(Feulgen)核染色法原理,细胞内的DNA在1mol/L HCl 60水解时部分地破坏了脱氧核糖与嘌呤碱基之间的糖苷键而使嘌呤碱基脱掉，从而使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的醛基暴露。,无色的亚硫酸品红（Schiff试剂）是由偏重亚硫酸钠、盐酸和碱性品红配制成的。偏重亚硫酸钠与盐酸能产生亚硫酸根，当具有醌式结构的碱性品红分子与亚硫酸根结合后，醌式结构的共轭双键被打开，碱性品红变为无色。当用这种无色的亚硫酸品红去染色经酸解的细胞时，就会与染色体DNA上游离的醛基结合，又出现了醌式结构，从而使DNA着色，使染色体呈现出红色。,*孚尔根染色法的优点是制片清洁，染色体清晰，组织软化好，易于压片。其缺点是，染色体较软，容易缠绕，不易分散，在加强前处理使染色体缩短的情况下，可获得较好的效果。,三）、细胞微核测试原理,微核(micronuclei,MCN)是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。,一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成第三个核块。即在间期细胞形成时，核附近出现的一到几个很小的圆形结构，直径大约是主核1/3以下呈圆形、椭圆形或不规则形，这就是微核（micronucleus）,微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面,是一种比较理想的方法。,三、材料及用品,1、材料,洋葱/大蒜（2n=16），刮去老根，放在小烧杯上，加水至刚与根部接触为止，室内培养至新根长出0.51.0cm左右。分2组分别用于多倍体诱发和微核测试。,2、器具及药品,(1)器具,恒温培养箱，电热恒温水浴槽，显微镜，磨口带塞试管，镊子，刀片，载玻片，盖玻片，吸水纸。,(2)药品,0.01%0.05%的秋水仙素水溶液，卡诺氏固定液，1mol/L HCL，希夫（Schiff）试剂，10%偏重亚硫酸钠，1%醋酸洋红等,四、实验内容和步骤,（一）、实验内容之一：,用秋水仙素诱发植物产生多倍体；,通过取材、固定、解离、孚尔根染色法制片、镜检观察。以室温酸解洋葱根尖材料与,60,C,酸解做对照，用醋酸洋红,/,改良石碳酸品红染色方法与孚尔根染色法作对照；,找出根尖细胞中期分裂相，确定诱发成功的细胞，观察加倍根尖细胞的染色体数目。,实验内容之二：,学生自行设计处理方案，用化学药剂或特定污染物处理洋葱或大蒜根尖细胞，观察细胞有丝分裂时染色体畸变（微核、粘连、聚结、断裂等）。,（二）、实验步骤,内容之一 植物多倍体人工诱发及鉴定,1根尖培养,将洋葱或大蒜刮去老根，室内水培养至新根长出0.51.0cm左右。,2多倍体诱导,当洋葱或大蒜新根长至0.51.0cm左右时，用含0.010.05%秋水仙素的水溶液，置阴暗处培养4h2d，及时观察，至根尖膨大为止，再恢复生长（学生查阅资料，自主设计秋水仙素浓度梯度和时间梯度处理洋葱根尖）。,3固定,恢复生长的根尖用蒸馏水冲洗并用卡诺氏固定液(无水乙醇:冰醋酸=3:1)固定224h备用。,4解离,固定好的根尖，加入适量预热的1 mol/L盐酸，60,C水浴8-10分钟。,同时以室温下的盐酸解离根尖作对照。,5染色,将解离过的材料水洗3次，吸净水分，加入希夫试剂，盖好磨口试管塞，染色10分钟（在黑暗条件下处理）。,以室温下酸解和1%醋酸洋红染色作对照。,6 漂洗,希夫试剂染色后，先用蒸馏水冲洗，再用漂洗液密封漂洗3次，每次25分钟，再水洗23次。,7 压片,取根尖置于载玻片上，取分生区组织长约0.5mm，压碎，加盖玻片，覆以吸水纸压片；必要时敲击盖玻片以利分散。,8观察,低倍镜下寻找染色体分散良好的分裂相，换高倍镜观察并计数染色体数目，鉴别染色体加倍的细胞和未加倍的细胞。,内容之二 植物细胞的微核检测,1、根尖培养：将洋葱或大蒜刮去老根，室内水培养至新根长出0.51.0cm左右。,2、处理根尖：阳性检测采用 CrO,3,/NaN,3,/EMS，,另外自我设计1-2种测试物,，对照用自来水/蒸馏水处理，处理时间24h。,（必要时测试物浓度需稀释，以免根尖腐烂）,3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次2-3min，洗净后在水中恢复培养24h。,4、固定：用甲醛：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后弃去固定液，或换入70酒精中保存。,5、酸解：弃去固定液，用清水漂洗2-3次，吸净水，加入6 mol/L盐酸，于室温解离10min，弃去盐酸，漂洗根尖2-3次，彻底洗净盐酸。,6、染色：截下0.5-1mm长的根尖，滴加石炭酸品红染液，染色10min，加盖玻片，压片观察。,五、实验结果,染色体记数，区分染色体加倍和未加倍的细胞；,绘出所观察到的多倍体细胞的显微观察图；,总结说明秋水仙素诱导洋葱根尖多倍体的最佳浓度和时间。,绘制细胞微核实物图；每个根尖统计,1000,个细胞，计算每一处理（,3,个根尖）的平均微核千分率。,参考有关标准确定所设计测试物的污染指数（,PI,），提出你的建议。,六、思考题,1秋水仙素诱导多倍体的原理是什么?,2根尖经秋水仙素处理之后为什么会发生膨大?,3对照feulgen染色中用热盐酸处理与否的镜检结果之异同，说明水解时间和温度对染色效果的影响。,4分析醋酸洋红染色和孚尔根染色效果之异同。,5.在大蒜/洋葱根尖细胞微核检测中为什么要恢复培养？,七、注意事项,1Schiff试剂及时取放，及时清洗吸Schiff试剂的吸管。,2黑暗条件下染色。,3漂洗时要盖好磨口试管塞。,4用于压片的材料不可太多。,5.你怎样看待对照组出现的微核？,