血红蛋白的凝胶过滤

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,血红蛋白的凝胶过滤,Gel Filtration,凝胶排阻层析,(gel exclusion chromatography),分子筛层析,(molecular sieve chromatography),凝胶过滤,(gel filtration),凝胶层析技术及原理,凝胶,:,是胶体溶液凝固而成的固体物质，其内部是立体的网状结构,.,交联葡聚糖,(,sephadex,),琼脂糖凝胶,(,sepharose,),聚丙烯酰胺凝胶,(BIO-Gel P),硅胶,(,Silicon dioxide or Silica gel),葡聚糖,分子筛凝胶是一种,不带电,的具有三维空间的,多孔网状结构,的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，,小分子可以进入凝胶网孔,，而,大分子则排阻于颗粒之外,。,凝胶层析,(Gel chromatography,),:,凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。,任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数,Kav,（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。,Kav,值的大小与凝胶床的总体积（,Vt,）、外水体积（,Vo,）及分离物本身的洗脱体积（,Ve,）有关，即：,Kav,=(,Ve-Vo)/(Vt-Vo,),在限定的层析条件下，,Vt,和,Vo,都是恒定值，而,Ve,值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，,Kav,值小；反之，则,Kav,值增大。因此，在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生,排阻和扩散,效应。若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开,常用的色谱分离方法,一,.,按两相所处的状态分类,气相色谱法,:,气固色谱法,气液色谱法,液相色谱法,:,液固色谱法,液液色谱法,二,.,按固定相的几何形式分类,柱色谱法,纸色谱法,薄层色谱法,凝胶过滤技术特点,凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。,凝胶层析的应用,脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。,用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。,测定高分子物质的分子量,高分子溶液的浓缩,凝胶层析应用,1.,生物大分子的纯化,凝胶过滤是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶过滤成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶过滤无疑是一种合适的方法。,2,.,分子量测定,在一定的范围内，各个组分的,Kav,以及,Ve,与其分子量的对数成线性关系。,Kav,b,lg,MW,c,Ve,b,lg,MW,c,由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出,Ve,或,Kav,对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的,Ve,或,Kav,，,通过标准曲线即可求出其分子量。,3.,脱盐及去除小分子杂质,利用凝胶过滤进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。一般常用的是,Sephadex,G-25,，,另外还有,Bio-Gel P-6,等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，但价格较贵。,4.,溶液的浓缩,利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的,Sephadex,（,粗颗粒）加入溶液中，,Sephadex,可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和,pH,值。,5.,蛋白质的复性,为了减少高浓度下的聚集反应,凝胶过滤层析技术也可以用来进行蛋白的体外复性。层析介质的隔离作用,降低了蛋白之间相互作用产生的聚集,使复性浓度、复性率都得到很大的提高。同时,蛋白经过凝胶过滤层析本身也可得到一定的纯化。,为了提高蛋白质复性效率，发展了一种梯度凝胶过滤层析复性方法。在色谱柱中预先设置变性剂浓度的梯度，当复性的蛋白质进入到柱子中后，由于蛋白质的表观分子量远远大于变性剂的，从而蛋白质经过了一个变性剂浓度逐步降低的环境，蛋白质逐步地折叠复性，从而有效地降低了聚集体的形成，并能把聚集体和折叠的蛋白质进行分离。,影响分离效果的因素,1.,基质的颗粒大小、均匀度,2.,筛孔直径和床体积的大小,3.,洗脱液的流速,4.,样品的种类等，,5.,缓冲液的,pH,6.,而最直接的影响是,Kav,值的差异性，,Kav,值差异性大，分离效果好；,Kav,值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开,。,影响凝胶过滤的因素,层析柱的选择,一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过,100cm,加样量,加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。,凝胶柱的鉴定,凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡,洗脱速度,一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长,本实验的原理,本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入,FeSO,4,溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的,O2,结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。这样，就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。,实验主要步骤,凝胶溶胀,装柱,制备血红蛋白样品,平衡（,20min,）,上样和缓冲液洗脱,形成层析柱还原层,装柱注意事项,1.,装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。,2.,流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。,3.,进行实验时，注意与目标物分子量相似的尽量少。,4.,凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。,操作步骤,1,1.,装柱,:,检查上下柱帽是否通畅,将接线短的柱帽接在层析柱的下端,.,加入,1/8,柱体积的去离子水或磷酸盐缓冲液,搅拌小烧杯里的凝胶,并连续的装入层析柱中,使沉积后的凝胶高度不低于,12cm,接上上端的柱帽,将其连线插入三角瓶里磷酸盐缓冲液中,平衡,20,分钟,.,操作步骤,2,2.,上样前的准备,调节恒流泵的流速为,610,滴,/,分钟,并将其进水口与层析柱的下端接线相接,.,撤去柱上端的柱帽,放入与柱内径大小一致的滤纸片一块,检查胶面是否平整,层析柱是否均匀,.,然后将胶面上的缓冲液用排气键放至与胶面相齐,关上恒流泵,.,切忌干胶,!,步骤,3,A.,上样,FeSO4 0.5ml,于滤纸面上。开启恒流泵至液面与胶面相齐。关泵。,B.,上,1ml,磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。关泵。,C.,上,0.5ml,血红蛋白样，开泵，至液面与胶面相齐，关泵。,D.,同,B,操作。,E.,上,5ml,的磷酸缓冲液。接上上端柱帽与磷酸缓冲液，连续洗脱，观察现象，并用烧杯分别收集血红蛋白样品与铁氰化钾。,凝胶过滤层析中,小分子物质能进入填料内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。,Thanks a lot,