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,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,实验四 琼脂糖凝胶电泳检测,DNA,一、实验目的,通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测,DNA,的方法和技术，检测上次实验课提取的质粒,DNA,二、实验原理,带电物质在电场中的趋向运动称为,电泳,。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法,泳动率,是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比，与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率，在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率,影响泳动率的因素,包括,样品的物理性状,、,支持物介质,、,电场强度,和,缓冲液离子强度,DNA,的凝胶电泳常使用两种支持介质：,琼脂糖凝胶,和,聚丙烯酰胺凝胶,关于电泳,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度,DNA,分子在琼脂糖凝胶中泳动时有,电荷效应,和,分子筛效应,在碱性缓冲液中,DNA,分子带,负电荷,，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链,DNA,几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动,在一定的电场强度下，,DNA,分子的迁移速度取决于分子筛效应，即,DNA,分子本身的大小和构型,琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的,DNA,，也可以分离相对分子质量相同，但,构型不同,的,DNA,分子,可以分离长度为,100bp,至近,60kb,的,DNA,分子，常采用,TAE,、,TBE,和,TPE,三种缓冲体系,EB,：即溴化乙锭，它能够插入,DNA,分子中的碱基对之间而与,DNA,结合。由于,EB,分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的,DNA,条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测,10ng,的,DNA,注意：,EB,是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套,GoldView,:,是一种可代替,EB,的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测,DNA,时，,GoldView,与核酸结合后能产生很强的绿色荧光信号，其灵敏度与,EB,相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链,DNA,呈现绿色荧光，而且也可用于染,RNA,。,DNA,的染料,线性,DNA,片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系,琼脂糖凝胶的百分浓度,分离线性,DNA,片段分离的有效范围,(kb),0.3,60,5,0.6,20,1,0.7,10,0.8,0.9,7,0.5,1.2,6,0.4,1.5,4,0.2,2.0,3,0.1,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由,丙烯酰胺,单体和交联剂,甲叉丙烯酰胺,在催化剂,过硫酸铵,和加速剂,TEMED,的作用下聚合而成,可以分离小片段（,5,500bp,）,DNA,分子,聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用：,蛋白质分子的分离鉴定,蛋白质分子量的测定,核酸的分析,核酸序列测定,在,pH,值为,8.0-8.3,时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，,核酸分子带,负电,，在电泳时向正极移动,。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，在,分子筛,作用下，,使分子大小和构象不同,的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入,荧光染料,（如,EB,）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。,实验原理,三、仪器、材料与试剂,微波炉,琼脂糖凝胶电泳系统,紫外线透射仪,质粒,DNA,DNA marker,50TAE,6,凝胶加样缓冲液,琼脂糖,1,溴化乙锭溶液,溶解琼脂糖,分离质粒,DNA,片段,检测质粒,DNA,片段,电泳样品,DNA,相对分子质量标准物,电泳缓冲液,沉降,DNA,并起指示作用,电泳支持介质,嵌入,DNA,中，在紫外灯下显色,四、实验步骤,1.,装好制胶装置,用胶带将洗净、干燥的制胶板两端封好,(,一定封严，不能留缝隙,),使用,水平仪，,将胶板调至水平，,插入,适当梳子,2.,将,1g,琼脂糖加入,100ml 1TAE,电泳缓冲液,中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解（冷却到,60,，加入,5,l,的,1,EB,，并摇匀），则为,1,琼脂糖凝胶液,3.,将溶解的琼脂糖（约,50,）,倒入,，室温冷却凝固,4.,充分凝固后,小心垂直向上拔出梳子，,撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中,(,注意：,DNA,样品孔应朝向负电极一端,),，,加,1TAE,电泳缓冲液,至液面覆盖凝胶,0.5cm,5.,用移液器吸取质粒样品,5l,于封口膜上，再加入,1l,的,6,加样缓冲液,，混匀后，,小心加入点样孔,(,记录电样的顺序和电样量,),6.,打开电源开关，调节电压至,3,5V/cm,，可见溴酚蓝条带由负极向正极移动,(,注意,DNA,片段从负极向正极移动,),7.,当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿,1,2cm,处，停止电泳,8.,将凝胶置于紫外线透射仪上，打开紫外灯，,DNA,存在处显出桔红色荧光条带（,注意：紫外线对眼睛有伤害作用，应戴上防护眼睛,）,每班,4,组，约,30,人,每组,7,人：,1,套琼脂糖凝胶电泳系统（电泳槽、电泳仪、制胶板、有机玻璃槽、,8,孔梳子），,20L,或,10L,移液枪,1,支，冰盒,1,个，,50mL,锥形瓶,1,个（贴上,EB,标签）。,每班配,2,台电炉，线手套,2,副。,实验分组,五、思考题,EB,的中文名称是什么？使用,EB,时应注意些什么？,怎么制备一块,20mL,体积,1,琼脂糖凝胶（含溴化乙锭溶液终浓度,0.5,g/mL,）？,什么是,Loading Buffer,？,Loading Buffer,中含有哪些成分？各组分的作用是什么？,1,倒胶时把握好胶的温度，不要高于,60,，否则温度太高会使制板变形,2,胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔,3,点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多,4 EB,有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔,5,紫外线照射不要太久,注 意,凝胶电泳槽,
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