生化实验技术与方法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,糖的薄层层析,实验原理,薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和定量测定。,根据原理的不同薄层层析通常有,4,种类型：吸附薄层层析，分配薄层层析，离子交换薄层层析和薄层电泳。,实验操作,硅胶薄板的制备,：注意胶要均匀。,1.2 g,硅胶,H,加,4.0 ml0.5%CMC,溶液，研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃板上，铺开，使浆液分部均匀，放在水平台上，自然晾干。,2.,板的处理,：,薄板的活化：,105,，,0.5h,薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图谱呈弧形带状，使,Rf,值相近的化合物也能清楚地分开。,3.,点样：,样品为鼠李糖、木糖和葡萄糖。点样量,8-10l,。注意：点样点的直径小于,5mm,，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。,4.,展层：,展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水,=12,：,3,：,3,：,2,（体积比），新鲜配制。,5.,显色,：显色剂：苯胺,-,二苯胺,-,磷酸试剂。,20mm,10mm,30mm,8mm,苯丙氨酸解氨酶的提取纯化,实验原理,苯丙氨酸解氨酶（,L-phenylalanine,：,ammonia lyase,，简称,PAL,；）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。,本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。,仪器,高速冷冻离心机；恒温水浴；电子天平；柱层析系统,试剂,酶提取液：,0.1mol/L,硼酸,-,硼砂缓冲液（含,1mmol/LEDTA,、,20mmol/L-,巯基乙醇）,固体硫酸铵,0.02mol/L,磷酸盐缓冲液（,pH8.0,，含,0.5mmol/LEDTA,，,2.5%,甘油，,20mmol/L-,巯基乙醇）；,DEAE,纤维素,52,操作步骤,酶液提取,（,1,）植物材料,2g,，剪成小段，加入,5,倍体积的酶提取液，于冰浴上用研钵研磨。,（,2,）将已匀浆的酶液转入离心管，,4000r,冷冻离心,30min,。,（,3,）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，留样,0.5ml,。,硫酸铵分级沉淀酶蛋白,（,1,）根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到,38%,饱和度应加入,酶粗提液,中的硫酸铵量，并称硫酸铵。（,240g/L),（,2,）将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，再缓慢搅拌,10min,；然后于,9000r,离心,15min,，保留上清液于烧杯内。,（,3,）根据硫酸铵饱和度用量表，算出从,38%,到,75%,饱和度所需硫酸铵用量。,（,222g/L),（,4,）按上述（,2,）步同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。,（,5,）将沉淀溶于,2ml,酶抽提液中,留样,0.5ml,。,透析脱盐,酶液装入透析袋，放入低盐溶液中透析过夜,留样,0.5ml,。,银杏叶,2g+10ml,酶提取液研磨,4000rpm,、,30min,取,上清液,加硫酸铵至饱和度,38%,9000rpm,、,15min,取,上清液,加硫酸铵至饱和度,75%,9000rpm,、,15min,取,沉淀,溶于,2ml,酶抽提液,透析,纯化,离子交换层析,-DEAE,纤维素,（,1,）称取,DEAE,纤维素,52,干粉,11.5g,，加,20ml,的,0.02mol/L,磷酸盐缓冲液（,pH8.0,）浸泡,4h,以上（或浸泡过夜）。,（,2,）装柱：把预处理的,DEAE,纤维素,52,装柱。装柱完成后，用,23,个床体积的,0.02mol/L,磷酸盐缓冲液（,pH8.0,）洗脱平衡该柱。,（,3,）上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，上样结束后，在床面以上小心地加入,0.02mol/L,磷酸盐缓冲液,23cm,厚液层。注意上样开始就收集流出液。,（,4,）洗柱：约用,2,倍床体积的,A,液（,0.02mol/L,磷酸盐缓冲液）及,B,液（含,1mol/LNaCl,的,0.02mol/L,磷酸盐缓冲液）洗柱，按洗脱管编号，取,A280,值高的管中洗脱液测其,PAL,的活力；合并主要含有,PAL,活力的各管洗脱液，并量出其体积（,ml,）。,苯丙氨酸解氨酶,的活力测定,PAL,催化,L-,苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸，反式肉桂酸在,290nm,处有最大吸收值。若酶的加入量适当，,A290,升高的速率可在几小时内保持不变，因此通过测定,A290,升高的速率以测定,PAL,活力。规定,1h,内,A290,增加,0.01,为,PAL,的一个活力单位。,取试管,2,支，按表中所述（,0,号为调零管，,1,号为测定管。注意按表格从上到下的顺序加入试剂）。（单位：,ml,）,试剂类型,调零管（,0,号）,待测管（,1,号）,pH8.7,的,0.1mol/L,硼酸缓冲液,3,2,0.1mol/L L-,苯丙氨酸溶液,0,1,样品（酶）溶液,0.1,0.1,将各管混匀，放入,40,恒温水浴保温,1h,（准确计时），到时各加,0.2 ml 2 mol/LHCl,终止反应。,紫外分光光度于波长,290nm,处测定,1,号管的,A290,。,蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）,取酶液,0.1ml,，用蒸馏水稀释至,5ml,取试管,8,支，按下表加入各溶液：,将上述各试管混匀，静置,2min,，测定各管的,A595,。,试管编号,0,1,2,3,4,5,6,7,标准蛋白质溶液（,ml,）,50ug/ml,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,/,/,稀释酶液（,ml,）,/,/,/,/,/,/,1.0,1.0,蒸馏水（,ml,）,2.0,1.8,1.6,1.4,1.2,1.0,1.0,1.0,考马斯亮蓝（,ml,）,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,PAL,总活力、比活力、蛋白质含量的计算,步骤,体积（,ml,）,蛋白质含量,（,mg,）,总活力（,m,）,比活力,（,m/mg protein,）,粗提,硫酸铵沉淀,透析,离子交换层析,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,（,SDSPAGE）,测定蛋白质分子量,原理：,SDS,PAGE,是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。,电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。,SDS-PAGE,是在,PAG,系统中引进,SDS（,十二烷基磺酸钠）。,SDS,的作用：,1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性。,2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成,SDS-,蛋白质复合物。,SDS-,蛋白质复合物的特点：,1.由于结合大量的,SDS，,使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。,2.复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。,因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。,测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，,lgMr,为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的,lgMr,，再换算成蛋白质分子量,在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：,logMW=K-bX，,式中：,MW,为分子量，,X,为迁移率，,k、b,均为常数。,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量,。,操作如同,PAGE。,样品：蛋白质要完全变性。,蛋白质+,SDS+,巯基乙醇 100 2-5分钟,标准蛋白市场有售，被测蛋白质的分子量应在标准蛋白分子量以内。,染色：,考马氏亮蓝、银染色,该法测定蛋白质分子量的局限性：,1.蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，测定时只是它们的亚基或单条肽链的,MW。,2.,电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）,3.结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）,4.带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）,实验操作,编号,溶液名称,12%,分离胶,4%,浓缩胶,1,30%Acr 0.8%Bis,2.0ml,0.2ml,2,pH 8.8 Tris-HCI,1.25ml,-,3,pH 6.8Tris-HCI,-,0.375ml,4,10%SDS,50ul,15ul,5,TEMED,5ul,5ul,6,10%AP,50ul,15ul,7,H,2,O,1.65ml,o.9ml,总体积,约,5 mL,约,1.5 mL,胶的制备,标准蛋白质,分子量,兔磷酸化酶,B,97 400,牛血清白蛋白,66 200,兔肌动蛋白,43 000,牛碳酸酐酶,31 000,胰蛋白酶抑制剂,20 100,鸡蛋清溶菌酶,14 400,样品的处理：按,0.5mg,蛋白质,/1mL,溶液的比例向标准蛋白质或待测样品中加入样品溶解液（小试管），充分溶解后，置沸水浴,3min,，取出冷至室温。,加样量：,20l,，标准蛋白（,M,）全加。,电泳：点样端负极，恒压：开始,80V,，待样品进入分离胶后,120V,。,电极缓冲液：,pH 8.3 Tris,Gly,染色：脱色考马斯亮兰,R-250,，,1h,或过夜。,脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液（冰醋酸：蒸馏水：甲醇,=75,：,875,：,50,）脱色,1h,。,测定各条带的相对迁移率，将已知分子量的标准蛋白质的相对迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，根据未知蛋白质的电泳相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量,。,