基因的克隆方法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,第三章,基因的克隆方法,1,前言,基因,是生物染色体上的,一段DNA序列,，具有转录、翻译成某种蛋白质调控生物生命活动的功能。,2,基因的表达过程,mRNA,翻译成蛋白质,基因组DNA,3,如何获得基因？,即基因的克隆方法,基于,基因产物,的基因克隆方法,基于,基因加标签,的基因克隆方法,基于,基因序列,的基因克隆方法,基于,基因图谱,的基因克隆方法,4,一、基于基因产物的基因克隆方法,mRNA,翻译成蛋白质,1、根据,蛋白质序列,克隆目的基因,2、根据,基因表达差异（mRNA）,克隆基因,5,原理：根据蛋白质上的一段多肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，然后设计探针或引物从基因组文库或cDNA文库中分离出相应的基因。,1、蛋白质序列克隆法,6,实用性：,分离纯化蛋白质十分困难,Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile,TGT,ATG,GAC,GAA,ATG,AAA,AGA,AAC,ATA,C,T,G,ATG,G,G,T,T,C,据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列,注意！,密码子有简并性现象！,7,2、根据基因表达差异（mRNA）克隆基因,基因表达的差异表现：,一是基因表达的种类的不同；,二是基因表达水平的改变。,8,差减杂交（SH）,抑制性差减杂交（SSH）,差异显示PCR（DD RT-PCR）,DNA代表性差异分析（DNA RDA）,扩增限制性片段长度多样性（AFLP）,cDNA微阵列,已发展的相应基因克隆方法：,9,差减杂交（SH）,最早由,Lamar,和,Palmer,于,1984,年提出并用于雄鼠,Y,染色体的,DNA,研究。,超声波,打断雌鼠的DNA（过量100倍）,(XX),MboI,完全消化雄鼠的DNA,(XY),变性、复性,去除共有序列,BamHI,酶切表达载体,连接、转化、测序分析,缺点：技术要求高，耗时，工作量大,NO.1,NO.2,NO.3,10,SH,在,mRNA,研究上的应用机理：,!,不足之处：重复性差，灵敏度低，回收的cDNA量有限。,特异表达基因的样本（TS）,无特异表达基因的样本（RS）,提取mRNA,提取mRNA,cDNA,cDNA,转录,转录,过量,杂交,TS的CDNA纯化、富集、扩增,去除过量的RS的cDNA及杂交分子,11,基因突变体的研究：如基因的表达与不表达；,基因时空表达的研究：如根、茎、叶；,不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。,差减杂交技术的应用方面,：,12,1.2.2 抑制性差减杂交（SSH）,Tester样本mRNA,Driver样本mRNA,SfiI A,cDNA,cDNA,SfiI B,A,B,混合，变性杂交,过量,A,B,PCR扩增,5,3,13,应用,基因突变体的研究：如基因的表达与不表达,基因时空表达的研究：如根、茎、叶,不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照,14,1.2.3 差异显示PCR（DD RT-PCR）,最先由,Liang,等于,1992,年报道，目前已广泛在实验室使用。,主要原理：利用真核生物,mRNA,结尾处有,POLY,（,A,）,结构，在其,3,端设计象,5-T11,GA,样引物，该引物可,与,mRNA,总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合,5,端的随机引物（,20,条,10-mer,），,可以使不同长度的基因得到扩增。,5,3,AAAAAAAA,A,T,G,C,A,G,C,TTTTTTTTTT,RP,mRNA,15,5,3,AAAAAAAA,A,T,G,C,A,G,C,TTTTTTTTTT,RP,mRNA,AATTTTTTTT,ACTTTTTTTT,AGTTTTTTTT,TATTTTTTTT,TCTTTTTTTT,TGTTTTTTTT,CATTTTTTTT,CCTTTTTTTT,CGTTTTTTTT,GATTTTTTTT,GCTTTTTTTT,GGTTTTTTTT,16,17,具体操作：,1、提取mRNA；,2、特定引物（12分之一）反转录；,3、特定引物和RP结合RT-PCR；,4、把不同处理的样品扩增产物按引物组合分别进行电泳比较DNA带，从而找出差别DNA。,18,缺点：,假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。,工作量大。,无法定量研究。,扩出的条带往往是3端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。,19,优点：,简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。,所需的mRNA量少。,各样本mRNA的差异可同时进行比较。,扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。,20,二、基于基因加标签的基因克隆方法,原理：主要是在生物基因组中,插入外源的一段DNA,，使生物体产生某种突变表型，然后反过来利用这段外源已知的DNA片段来克隆基因的方法。,21,外源DNA,基因组染色体DNA,基因A,产生突变型,分类：,T-DNA标签法,转座子标签法。,22,T-DNA标签法克隆基因技术路线：,农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。,建立突变体基因组文库及野生型基因组文库,.,用,T-DNA,片段做,probe,筛选突变体文库，获得阳性克隆。,用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。,把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。,23,野生株,转基因株,目的基因,染色体,T-DNA,染色体,T-DNA探针,筛选转基因文库,作探针筛选野生株基因文库,构建基因组文库基因苗,构建基因组文库基因苗,阳性克隆,目的基因,获得阳性克隆,基因序列分析，确定为基因,阳性克隆转化突变体，确定基因功能,24,转座子标签法,转座子又称,转座因子或者跳跃因子,，实际上也是,DNA,片段,，它可以在生物的染色体组中移动，从染色体的一个位点跳到另一个位点，或从一条染色体跳到另一条染色体上，引起基因功能的改变。,25,转座子标签法,最早是美国玉米育种家,1951,年发现，起初不被认同，,1967,年在大肠杆菌的半乳糖操纵子中证实后得到认同。,根据,DNA,的结构和转座的机理，分为两大家族：转座子和逆转座子，前者如玉米的,Ac/Ds,系统,和,spm,因子，后者如果蝇的,copia,因子。,26,转座子根据结构不同可以分为简单转座子和复杂转座子,简单转座子：可以直接插入到其他位置,也叫插入序列。,复杂转座子：携带有其它基因或遗传标记。,结构共同点：,两端含有,20-40,个核苷酸的倒置重复序列。,含有可编码转座酶的基因。,应用：以,Ac/Ds,系统为例,27,Ac/Ds系统操作原理,把,Ac,，,Ds,分别转化并获得转化体。,把,Ac,转化体同,Ds,转化体进行杂交得到,F1,代，然后自交得到,F2,、,F3,代分离群体，找出稳定突变个体。,用,Ds,做,probe,筛选突变体文库获得突变基因的部分序列。,用上述序列筛选正常个体基因组文库或,cDNA,文库，得到目的基因。,28,三、,基于基因序列的基因克隆方法,根据克隆的策略的不同，基于基因序列的基因克隆方法又可以分为两种形式：通过分子杂交克隆法和通过PCR扩增基因法,29,1、,通过分子杂交克隆法原理：,根据基因序列上的同源保守性，从一种生物中分离获得的基因用于制作分子探针，从另一种生物的基因文库中分离出此生物中的同源基因。,30,1）,直接从基因组中扩增过程：,（,1,）提取基因组,DNA,作,模板,（,2,）根据目的基因序列,设计引物,（,3,）,PCR,扩增及产物鉴定,2、,通过PCR扩增基因法原理：,根据基因序列结构特征，设计基因特异引物，利用PCR技术直接从生物的基因组或是cDNA中扩增出目的基因。,31,提取基因组,DNA,PCR,引物设计,真核生物基因组含有内含子！,此法适合扩增原核生物基因。,PCR,扩增,基因序列分析,32,（,1,）提取基因组,total RNA,（,2,）反转录合成总,cDNA,作模板,（,4,）,PCR,扩增及序列分析,（,3,）根据目的基因序列设计引物,2）,从,mRNA,中扩增,:RT-PCR,原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。,适合扩增真核生物基因。,33,4、,基于基因图谱的基因克隆方法,又称图位克隆法，是建立在拥有RFLP等分子标记的连锁遗传图和基因文库，基因产物未知的一种基因克隆技术，理论上可以分离任何一个突变基因。,34,染色体,分子标记A,分子标记B,目的基因,阳性克隆,转化互补实验,基因图位克隆示意图,35,图位克隆基因的一般操作过程：,通过遗传分析构建与目标基因紧密连锁的分子标记连锁图，达到基因的精细定位。,用与目标基因紧密连锁的两侧分子标记,筛选基因组文库,，构建包含目标基因的基因组物理图谱。,目的基因,标记1,标记2,标记3,标记4,标记5,36,染色体,分子标记2,分子标记3,目的基因,基因组物理图谱,进一步精细定位,获得目的基因,37,通过染色体步移或染色体登陆技术对目标基因进行进一步精细定位，得到阳性克隆。,对阳性克隆转化隐性受体进行功能互补。,基因序列测定及表达分析等。,38,影响基因图位克隆的因素：,建立的分子标记遗传图中标记与基因之间的距离大小。,基因组的大小及可能存在的大量的重复序列。,基因组文库的大小及单克隆的大小。,成功的例子：,水稻,Xa21,拟南芥的,RPM1,，,RPS2,等。,39,图位克隆基因需满足的条件：,较理想的遗传图谱和物理图谱，如SSR、RFLP图谱。,大片段的基因组文库（BAC，PAC，TAC等）。,遗传转化技术。,40,其它的基因克隆法,cDNA,捕捉法,RNAi,：,RNA,干涉法,酵母双杂交法,。,41,思考题,请简单阐述SH在mRNA水平上克隆差异表达基因的机理。,42,