对流免疫电泳(免疫学实验)

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,对流免疫电泳,一、基本原理,在,pH,值,8.6,的,琼脂,凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负,电荷,，而且它分子又较大，所以泳动慢，受电渗作用的影响也大，往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子又较小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但仍能向正极泳动。如将抗原置阴极，抗体置阳极，电泳时，两种成分相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，并在比例适当的地方形成肉眼可见的沉淀线。这样由于电泳的作用，不仅帮助抗体定向移动，因而加速了反应的出现，而且也限制了琼脂扩散时，抗原抗体向四周自由扩散的倾向，因而也提高了敏感性，本法比琼脂扩散法的灵敏度要高,10,16,倍，而且反应时间短，可用于各种蛋白的定性和半定量测定,。,二、,对流免疫电泳,即双扩,+,电泳技术,用途,：同双扩,优点,：快、敏感性高,缺点,：分辨力低,三、操作方法,1,制琼脂板 以,pH8.6,离子强度,0.05,巴比妥缓冲液配成,1%,1.5%,琼脂凝胶板，厚度,2mm,3mm,。,2,打孔 琼脂冷却后，按图打孔，打成对的小孔数列，孔径,0.3cm,0.6cm,，孔距,0.4cm,1.0cm,。挑去孔内琼脂，封底。,3,加样 一对孔中，一孔加抗原，另一孔加抗体。,4,电泳 将抗原孔置于负极端。电流强度,3mA/cm,6mA/cm,，电泳时间,30min,90min,。,四、结果观察,断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中,37,数小时或置电泳槽过夜再观察。,五、注意事项,1,抗原抗体浓度的比例 当抗原抗体比例不适合时，均不能出现明显可见的沉淀线。,2,适当的电渗作用在对流免疫电泳中是必要的。当琼脂质量差时，电渗作用太大，而使血清中的其它蛋白成分也泳向负极，造成非特异性反应。在某些情况，琼脂糖由于缺乏电渗作用而不能用于对流免疫电泳。,4,当抗原抗体在同一介质中带同样电荷或迁徙相近时，则电泳时两者向着一个方向泳动。故不能用对流免疫电泳来检查。,