蛋白质翻译后修饰与加工

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 蛋白质翻译后修饰与加工,蛋白质翻译后修饰,是指在,mRNA,被翻译成蛋白质后,对蛋白质上个别氨基酸残基进行共价修饰的过程,.,蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用,.,人类基因组计划的完成是,20,世纪最伟大的科技成果之一。在对人类基因组进行仔细研究后发现,人类基因大约有,30000-50000,个，这仅仅是线虫和果蝇染色体基因数的,3-5,倍,.,而生命体内复杂生命过程的调控,仅仅靠这样小数目的基因远不能满足需要。,因此,蛋白质翻译后修饰过程尤为重要，它使蛋白质的结构更为复杂,功能更为完善,调节更为精细,作用更为专一。,细胞内许多蛋白质的功能,是通过动态的蛋白质翻译后修饰来调控的,;,细胞的许多生理功能,例如细胞对外界环境的应答,也是通过动态的蛋白质翻译后修饰来实现的。人类生命过程的复杂性不单是基因直接表达的结果,正是蛋白质翻译后修饰,使得一个基因并不只对应一个蛋白质,从而赋予人类生命过程更多的复杂性,.,在真核动物细胞中有,20,多种蛋白质翻译后修饰过程，常见的有泛素化、磷酸化与去磷酸化、糖基化与去糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。,近年来,随着人类基因组和蛋 白质组学工作的开展,关于蛋白质翻译后修饰的研究也取得一系列进展,.,磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程,;,糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用,;,脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用,;,组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关。 在体内，各种翻译后修饰过程不是孤立存在的。,原核生物中肽链起始合成时，,N,端为甲酰甲硫氨酸，真核肽链合成时,N,端是甲硫氨酸，但是成熟的蛋白质中,N,端并无甲酰甲硫氨酸，大多数蛋自质的,N,端也不是甲硫氨酸。,在生物合成过程中新生的肽链,N,端由去甲酞基酶去除甲酰甲硫氨酸残基的甲酰基，氨肽酶去除,N,端甲硫氨酸或,N,端某些氨基酸残基。一些分泌性蛋白质、激素及酶最初合成的是不具有生物活性的前体，如白蛋白原、胰岛素原等。,蛋白质前体要经过蛋白酶切割，去除一部分肽段后才具有活性。它可以分为两种类型：蛋白质前体在细胞内被加工成有生物活性的蛋白质，然后分泌到胞外；蛋白质前体被分泌到胞外或消化道，被蛋白酶加工成有生物活性的蛋白质，如前胶原分子活化为胶原分子，胰蛋白酶原激活等。,第一节 蛋白质的糖基化,大多数蛋白质以糖蛋白形式存在,它们包括酶、免疫球蛋白、载体蛋白、激素、毒素、凝集素和结构蛋白,功能涉及细胞识别、信息传递、激素调节、受精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统恒态维持等各个方面。而且知道,病菌、病毒的侵染，癌细胞的增殖及转移,自身免疫疾病等都与细胞表面的糖密切相关。,糖蛋白是蛋白质通过共价键与糖类结合的复合物，其中的糖基少则只有一个，多则可达数百个，后者的糖基常常连接成寡糖链，又称为聚糖（,glycan,）。,1,，糖肽连接键的类型,一条寡糖链与蛋白质中氨基酸残基可通过多种方式共价连接，从而构成糖蛋白的糖肽连接键（简称糖肽键）。参与糖肽共价连接的氨基酸种类较少，常见的是丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、羟赖氨酸、羟脯氨酸。,O-,糖肽键连接,N-,糖肽键连接,GalNAc,乙酰半乳糖胺,GlcNAc,乙酰葡萄糖胺,Roles of,oligosaccharides,in recognition,and adhesion,at the cell surface,(2),凝集素的特异结合作用,凝集素是一类广泛存在于自然界的一大类非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，它能与糖专一性地、非共价地可逆结合，并且有凝集血细胞的作用，故称为凝集素。,凝集素可与糖专一性地结合。目前按结合糖的类型，凝集素可分为六类：,D-,甘露糖或,D-,葡萄糖；,N-,乙酰氨基葡萄糖；,N-,乙酰氨基半乳糖；,D-,半乳糖；,L-,岩藻糖；唾液酸。,在植物凝集素中，只有麦胚凝集素（,WGA,）可专一结合唾液酸。,细胞间的粘附是细胞间相互作用起决定性作用的起始步骤。作为致病的微生物，首先对宿主细胞进行粘着，然后才能感染和致病。,细胞表面的凝集素能专一地识别并结合另一细胞的糖链。凝集素的这种特性，在细胞与细胞，细胞与基质的粘附中起一定作用。,1990,年,11,月，三个小组同时发现了血管内皮细胞白细胞黏附分子,1,（,ELAM,1,），后改称,E,选择素（,E-selectin,），又称为动物凝集素，能识别白细胞表面的,SLe,x,(,一种血型抗原,),四聚糖。,当组织受损或感染时，白细胞黏附于内皮细胞，沿血管壁滚动并穿过管壁进入受损组织，杀灭入侵病原物，但过多的白细胞聚集，则会引起炎症及类风湿等自身免疫疾病。,美籍华裔科学家王启辉首先用酶法合成了,SLex,，并已由,Cytel,公司生产。,Glycomed,公司则从中药甘草中，找到了,SLex,的类似物甘草素，可用于封闭血管内皮细胞表面的,E,选择蛋白，从而达到抗炎的目的。,Slex,及其模拟物的结构,（,3,）构成某些抗原的决定子,聚糖与细胞和生物分子的一个很重要的特性就是表型和抗原性，据此细胞和分子能彼此区别，人类的,ABO,血型以及相关血型抗原性是由糖链决定的。,A,型和,B,型抗原决定簇的不同只是在于糖蛋白和糖脂中的糖链的非还原端的一个糖残基：,A,型为,N-,乙酰氨基半乳糖,(GalNAc),；,B,型为半乳糖,(Gal),。,A,型血的个体，他们的血液中含有抗,B,型糖链结构的抗体；,B,型血的个体，其血液中则有抗,A,型糖链结构的抗体。一旦输入不同血型的血液，就有可能引起免疫反应。,O,型血的个体的相应的糖链结构少了,AB,抗原非还原端的,Gal,或,GalNAc,。为此，这样的糖链结构不会和抗,A,或抗,B,的抗体结合引起免疫反应。这样的血型抗原物质不仅存在于一些红细胞的表面，而且也存在于一些表皮细胞的表面,。,三、糖蛋白的生物合成,糖蛋白是复合蛋白，因此，糖蛋白的生物合成自然包括蛋白质的合成和糖链合成两个部分。糖蛋白中蛋白部分的合成和其他蛋白质的合成一样是在细胞质中的核糖体上进行，只是在肽链生物合成的同时或合成后，糖链作为一种翻译后加工的过程被接到肽链上的特定的糖基化位点。,糖链的存在对肽链的折叠，糖蛋白的进一步的成熟、分拣、投送，以及最后的定位都有重要的影响。,1,，,N-,糖链的合成,N-,寡糖链前体的开始合成是在内质网进行，随后又在高尔基体内加工，全部合成大致可分为四步进行。,（,1,）合成以酯键相连的寡糖链前体；,（,2,）将寡糖链前体转移到正在增长着的肽链上；,（,3,）除去寡糖链前体中的某些糖单位；,（,4,）在剩余的寡糖核心上在加上另外的糖单位。,1,）寡糖链前体的合成,2,）寡糖链前体的转移,在寡糖链前体生物合成后，被完整地转移到新生肽链的某些,N-,糖基化位点上（反应,1,），在合成过程中作为糖基载体的,Dol-P-P,被游离出来。,Dol-P-P,经磷酸酶水解释放出无机磷酸，变成磷酸长萜醇被循环使用。,3,）寡糖链前体的后加工,转移到新生肽链上的寡糖链前体的后加工开始于内质网，首先由两个不同的,-,葡萄糖苷酶分别切除由,Man,延伸的,3,个,Glc,（反应,2-3,）和,1,个,Man,（反应,4,），随后尚未完成加工过程的糖蛋白被裹在由膜形成的囊泡中转移到高尔基体进一步加工。,4,）,N-,糖链的成熟,N-,糖链的成熟过程是在高尔基体内进行的。在糖蛋白通过高尔基体膜囊的途中，甘露糖残基已经过修剪，,N-,乙酰葡萄糖胺、半乳糖、岩藻糖以及唾液酸残基都根据需要连接到糖蛋白分子上，从而完成它的加工（反应,1-7,）。,3,，,O-,糖链的生物合成,O-,糖链的结构比,N-,糖链简单，但是种类比,N-,糖链多，肽链中可以糖基化的主要是丝氨酸和苏氨酸，此外还有酪氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸，连接的位点是这些残基侧链上的羟基氧原子，后者可以和很多种单糖生成糖苷键，其中以通过,GalNAc,和丝氨酸或苏氨酸残基相连的,O-,糖链,(,以下简称为,O-GalNAc,糖链,),研究得最多，这是因为这类,O-,糖链分布最广。,为此,O-,糖链的生物合成中也以,O-GalNAc,糖链的生物合成研究得最详细。,狗颌下唾液腺,O-,连接糖链的合成途径,O-,糖链生物合成过程最清楚的是黏蛋白的生物合成，黏蛋白是由颌下唾液腺分泌的一种,O-,连接糖蛋白，它的合成是在高尔基体中进行的。,四、蛋白糖基化和去糖基化的化学调控,在生物体内，大多数蛋白质都是以糖蛋白形式存在，它们包括酶、免疫球蛋白、载体蛋白、激素、毒素、凝集素和结构蛋白，涉及到细胞识别、信息传递、激素调节、受精、发育、神经系统和免疫系统恒态维持等各个方面的功能。,许多疾病的发生和发展，如炎症及自身免疫疾病、老化、癌细胞异常增殖及转移、病原体感染等都与糖蛋白寡糖链的变化密切相关。,因此，针对糖链的变化，利用小分子化合物抑制糖苷转移酶和糖苷酶的催化活性，可以控制糖链的合成和水解，从而达到治疗疾病的目的。,糖蛋白的去糖基化酶,去糖基化的目的有三,: (,一,),检测碳水化合物在糖蛋白功能中的作用。,(,二,),测定糖蛋白中蛋白质部分的分子量,尤其在重组,DNA,研究中,证明所产生的蛋白质是否为目的蛋白。,(,三,),制备抗蛋白质抗体。,去糖基酶有三类,:,外切型糖苷酶、内切型糖苷酶和糖胺酶,(N-,糖肽酶,),。,外切型糖苷酶能从糖链的非还原末端释放寡糖。例如,:,唾液酸酶、,-,半乳糖苷酶、,-N-,乙酰氨基葡萄苷酶、,-L-,果糖苷酶、,-N-,乙酰氨基半乳糖苷酶、,-,甘露糖苷酶、,-,甘露糖苷酶等等。,这些酶的应用有助于研究糖链的结构与功能的关系。例如,:,促红细胞生成素的去糖基化,当末端的糖即唾液酸、半乳糖、,G1cNAc,被专一性的糖苷酶去掉时,在体外测其活性逐渐提高,进一步切去内部糖链则导致活性丧失。,内切型糖苷酶有如下几类：这些酶由于都是从糖链内部专一性切开某个键，因此在糖链结构分析以及结构与功能关系研究中非常有用，也是目前糖基化工程中的重要酶,，可应用于生物学的多个领域。,例如：近年来内切型,-,半乳糖苷酶结合单克隆抗体，免疫化学方法检测红细胞表面带有血型,Ii-,抗原的乳糖胺聚糖以及由聚乳糖胺修饰末端的各种抗原包括,ABH,和,SSEA-1(Lex),，建立了正常人红细胞聚乳糖胺轮廓，并分析了遗传性贫血病人的不正常糖基化轮廓。发现这类病人的红细胞含增高的聚乳糖胺神经酰胺。和乳糖系列的糖脂,而其中有两条糖蛋白带很少被聚乳糖胺糖基化。这是一种糖基化缺陷病，现已对该病进行了广泛的分子生物学研究。,糖胺酶,(Glycoamidase, N-,糖苷酶,),，这类酶目前主要有两类,:,糖胺酶,A (,来自,Almond),和糖胺酶,F (,来自,flavobacterium meningo septicum),都水解寡糖,-G1cNAc-Asn-,肽,释放出完整的寡糖,并且对寡糖结构特异性较宽,甘露糖型、复合型、杂合型糖链均可释放,包括所有含果糖基,含二分型,Glc-NAc,、,-,木糖、,Gal-GlcNAc,重复单位以及含唾液酸基的,N-,乙酰乳糖氨型寡糖。但对肽分子专一性较强,只能释放含,3-40,个氨基酸的糖肽分子的糖基,对肽中氨基酸序列有一定要求。,目前使用较多的为糖胺酶,A,是分析,N-,糖链的有用工具,结合核磁共振,甲基化分析和外切型糖苷酶消化常用来定性分析由二维图谱分离的寡糖。,1,-,葡萄糖苷酶抑制剂,-,葡萄糖苷酶在机体的许多代谢过程中起着关键的作用，并与许多因代谢紊乱失调而引发的疾病有密切关系，如糖尿病、癌症、病毒感染等。,对肠道,-,葡萄糖苷酶具有抑制作用的一些化合物已成为治疗糖尿病的一类新药，如已经上市的治疗糖尿病的拜糖平和米格列醇等。,在寡糖链生物合成中，内质网内有两种,-,葡萄糖苷酶催化寡糖链前体最末端的,3,个葡萄糖基，以利于,N-,寡糖链的形成。因此，能够阻断寡糖链生物合成的,-,葡萄糖苷酶抑制剂，也被用作抗病毒和抗肿瘤的药物。,目前人们发现的,-,葡萄糖苷酶抑制剂可分为糖及其衍生物与非糖基化合物，其中糖及其衍生物按照已有文献分类，又可分为单糖类、双糖类、亚氨基糖类，碳糖与假糖氨类与硫糖类。其中研究比较多的,-,葡萄糖苷酶抑制剂属于亚氨基糖类（多羟基生物碱类）化合物，包括多羟基哌啶类、多羟基吡咯烷类、多羟基双稠吡咯烷类、多羟基吲哚里西啶类、多羟基去甲莨菪烷类、氨基环醇类等。,作为抗肿瘤、抗病毒使用的,-,葡萄糖苷酶抑制剂，需要进入细胞内质网，所以必须增加化合物的疏水性，例如已经上市的,N-,丁基,-1-,脱氧尻霉素（,N-,丁基,-DNJ,）和生物碱粟精胺的衍生物，即,6-O-,丁酰粟精胺酯（,6-O-butyl-cast,）等，可用做抗艾滋病、抗肝炎病毒药物。,近几年，人们也在一些糖类抑制剂基础上，开发出了几种较好的对内质网,-,葡萄糖苷酶,I,和,-,葡萄糖苷酶,II,具有较强抑制作用的糖类抑制剂。,人们根据天然产物的结构特点，也设计合成、筛选出几种新型的结构独特的,-,葡萄糖苷酶抑制剂，如,4-,甲基磺酰胺基查尔酮衍生物、,4-,甲基磺酰胺基苯甲酮衍生物，四氯邻苯二甲酰亚胺衍生物、二苯基脲衍生物、羟基肉桂酰苯乙胺、绿原酸衍生物等，其,IC50,值达到,mol/L,。,2,，,-,甘露糖苷酶抑制剂,-,甘露糖苷酶,I,和,II,主要存在高尔基体中，,-,甘露糖苷酶抑制剂不影响寡糖链前体中葡萄糖基的切除，但是可以终止,N-,糖链的进一步加工成复合型糖链，结果得到的糖链为高甘露糖型或杂合型的糖链结构。,甘露糖的衍生物甘露糖,-1-,脱氧尻霉素（,DMJ,）对,-,甘露糖苷酶,I,具有较强的抑制作用。苦马豆碱（,swainsonine, swain,）是,-,甘露糖苷酶,II,的特异性抑制剂，它能改变细胞表面的糖类抗原决定部位的表达，进而影响到肿瘤的转移和入侵，以及在体外的生长，表现出抑制肿瘤转移的能力。,3,，糖苷转移酶抑制剂,糖基转移酶是糖基化过程的关键酶。由于许多疾病的发生和发展过程中，糖苷转移酶的活性增高，导致糖链的天线数目增加，因此，糖苷转移酶抑制剂可以作为治疗某些疾病的特异性药物。,目前所发现的糖苷转移酶抑制剂大多数是根据该酶催化反应的底物结构和催化机制设计合成的，如人们设计了多种,UDP-Gal,类似物作为,-,半乳糖基转移酶的抑制剂以及,N-,乙酰氨基葡萄糖转移酶的抑制剂。,4,，神经氨酸酶抑制剂,流感病毒表面有两种糖蛋白：神经氨酸酶和血凝素。神经氨酸酶（,NA),可催化裂解宿主细胞和病毒粒血凝素和,NA,上糖侧链末端的唾液酸残基，从而促进病毒粒子从感染的呼吸道粘膜向周围组织扩散。,此外,NA,还同样具有病毒的致病性，通过改变表面糖蛋白血凝素的碳水化合物部分，增强病毒株的毒性，可引起流感症状和气道炎症的发生。,神经氨酸酶（又称为唾液酸酶，,NA,）抑制剂通过选择性地抑制、型流感病毒的神经氨酸酶，使病毒难以释放，并促进已释放的病毒相互凝聚，继而死亡。,流感病毒,流感病毒大致分甲、乙、丙三种类型。其中，甲型攻击力最强，而且极易变异，造成爆发或大流行。甲型流感病毒主要就是血凝素和神经氨酸酶的变异。病毒学家给编上了不同的编号，如,H1,、,H2,、,N1,、,N2,等。其中可以有一种或两种以上发生变异，专家根据这些编号给流感病毒分类。,第一个可抑制流感病毒,NA,的抑制剂是,2-,脱氧,-2,3-,脱氢,-N-,乙酰神经氨酸,(DANA,，,Neu5Ac2en),，但由于活性及其特异性太低，无临床使用价值。后来根据,NA,与底物唾液酸复合物的晶体结构合成了,4-,胍基,DANA(Zanamivir,，扎那他韦,),，对流感病毒,NA,抑制效果提高,500,倍。,1997,年设计了一种新型神经氨酸酶抑制剂,Oseltamivir(,奥司他韦,),，其与流感病毒,NA,比对人的同类酶的亲和力大,100,万倍，被认为是目前发现的特异性最高的药物，该药物于,1999,年在北美、欧洲和日本等地上市。,此外还有多种神经氨酸酶抑制剂类药物正处于前期开发中，如,BANA-113,、,A-192558,等。,6,，糖蛋白糖链扩展,第二节 蛋白质的磷酸化,当代生物化学和分子生物学发展最迅速的领域之一是关于细胞代谢、生长、分化、增殖和癌变调控的分子机理研究。,这个问题与生物信号分子如激素、神经递质、细胞因子（包括生长因子）、癌蛋白以及某些药物所携带的生物信息在细胞内传递密切相关。,研究表明，生物信号在细胞内传递的基本方式是蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白质磷酸化和去磷酸化，即,“,可逆蛋白质磷酸化作用,”,。,美国西雅图华盛顿大学医学院两位生物化学家克雷布斯（）和费希尔（,E.H. Fischer,）由于他们在,20,世纪,50,年代发现了,“,可逆蛋白质磷酸化作用,”,而荣获,1992,年诺贝尔医学奖。,40,多年来，特别是近,20,年来,“,可逆蛋白质磷酸化作用,”,的研究有了极大的发展，现在扩展到整个分子生物学和细胞生物学领域。,目前已经发现在真核细胞内就有,400,多种蛋白激酶和上千种磷酸化的蛋白以及种类繁多的蛋白磷酸酶。,这些蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化多种功能蛋白，如酶、激酶、受体、离子泵、离子通道、收缩蛋白、运输蛋白、调节蛋白、核内蛋白（组蛋白和非组蛋白，特别是转录因子和细胞周期蛋白）等，功能蛋白通过磷酸化和去磷酸化时两种构象互变所导致的活性、性质的改变而调节细胞内各种生命过程。,一、,蛋白激酶,蛋白激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将,ATP,的,磷酸基转移到底物特定的氨基酸残基上，使蛋白质磷酸化。,蛋白激酶在信号转导中主要作用有两个方面：其一是通过磷酸化调节蛋白质的活性，磷酸化和去磷酸化是绝大多数信号通路组分可逆激活的共同机制，有些蛋白质在磷酸化后具有活性，有些则在去磷酸化后具有活性；其二是通过蛋白质的逐级磷酸化，使信号逐级放大，引起细胞反应。,蛋白激酶,分类,真核生物中发现的蛋白激酶很多，根据其底物蛋白被磷酸化的氨基酸残基种类，可将它们分为,5,类,丝氨酸,/,苏氨酸,(Ser,Thr),蛋白激酶：蛋白质的羟基被磷酸化；,酪氨酸,(Tyr),蛋白激酶：蛋白质的酚羟基作为磷受体；,组氨酸蛋白激酶：蛋白质的组氨酸、精氨酸或赖氨酸的碱性基团被磷酸化；,色氨酸蛋白激酶：以蛋白质的色氨酸残基作为磷受体；,天冬氨酰基,/,谷氨酰基蛋白激酶：以蛋白质的酰基为磷受体。,此外，根据磷酸化的底物不同，还可将蛋白激酶分为组蛋白蛋白激酶、酪蛋白蛋白激酶等，但由于蛋白激酶可磷酸化底物的多样化，这种分法很不确切，已经被根据底物磷酸化氨基酸的分类方法所取代，有些如酪蛋白蛋白激酶，只是由于习惯而一直被沿用下来。,根据有无调节物将蛋白激酶分为信使依赖的蛋白激酶和非信使依赖的蛋白激酶，有些信使依赖的蛋白激酶的首字母缩略词已为人们所接受，如,cAMP,依赖的蛋白激酶,PKA,、钙和磷脂依赖的蛋白激酶,PKC,以及钙依赖钙调素不依赖的蛋白激酶,CDPK,等，它们彼此间存在结构和功能上的相关关系。,二、,蛋白磷酸酶,从理论上讲，蛋白磷酸酶在细胞内的生物信息传递中与蛋白激酶同样重要。但实验研究远不如蛋白激酶清楚。,已发现的蛋白磷酸酶分两类：一类是特异催化蛋白质丝氨酸或苏氨酸磷酯键水解的蛋白磷酸酶（,PP,）；另一类是特异催化蛋白质酪氨酸磷酯键水解的酪氨酸蛋白磷酸酶（,TPP,）。,蛋白磷酸酶分类,类型,蛋白磷酸酶,底物残基,PP-1,Mg,2+,-ATP,依赖性,蛋白磷酸酶,Ser,，,Thr,PP-2A,Ser,，,Thr,PP-2B,钙调神经磷酸酶,Ser,，,Thr,PP-2C,Mg,2+,依赖性蛋白磷酸酶,Ser,，,Thr,TPP,酪氨酸蛋白磷酸酶,Tyr,蛋白酪氨酸磷酸酶,蛋白酪氨酸磷酸酶,(Protein tyrosine phosphatase,，,PTP),是一种信号转导途径中的重要调节因子，与蛋白酪氨酸激酶,(Proteintyrosinekinase,，,PTK),一起控制着细胞内酪氨酸磷酸化水平，调节许多细胞功能,随着对,PTP,的深入研究，它们在人类内分泌疾病中的重要性被逐渐认识，特别是某些,PTP,对,2,型糖尿病,(DM2),的发生,发展具有更重要的意义，因而可成为抗,DM2,药物的作用靶点,PTP,的结构和功能,PTP,是一个多样化酶系，主要分为酪氨酸特异性,双特异性和低分子质量磷酸酶,3,大类,酪氨酸特异性和低分子质量磷酸酶主要作用于含磷酸化酪氨酸的蛋白质，双特异性磷酸酶作用于含磷酸化丝氨酸或含磷酸化苏氨酸的蛋白质,其中酪氨酸特异性磷酸酶又分为以,CD45PTP,为代表的受体样,PTP,和以,PTP 1B(PTPase1B)SHP 2(srchomology 2con tainingPTPase),为代表的胞内,PTP,PTP,与,2,型糖尿病的关系,胰岛素受体是一种通过与配体结合而被激活的跨膜酪氨酸激酶，其本身和下游底物酪氨酸的磷酸化可激活一系列胞内信号级联反应，而引发适当的生物反应，使体内糖代谢得以维持自身平衡,调节胰岛素信号转导的一个重要因素是,PTP,，后者既可作用于胰岛素受体,(Insulin receptor,，,IR),，又可同时作用于胰岛素受体的底物,(IRS),其中,IRS 1(Insulin Receptor Substrate 1),是胰岛素受体酪氨酸激酶的底物蛋白，能与含,SH2(src homology2),的蛋白质结合。,第三节 蛋白质的乙酰化,蛋白质乙酰化十分普遍，估计体内,50,的蛋白质有末端氨基的乙酰化，它能延长蛋白质在细胞内存在的时间。近年来发现组蛋白的乙酰化在活化染色质，使它作为转录及复制的模板中起重要作用。,组蛋白的乙酰化是由组蛋白乙酰基转移酶催化的，目前已发现一些转录因子本身就是这一种酶。例如人细胞核中的,TATA,结合蛋白,(TBP),的某些亚基可使,H3,和,H4,乙酰化。,乙酰化的组蛋白可被组蛋白脱乙酰基酶催化去除乙酰基，因此核心组蛋白乙酰化状态的调控在基因转录调控中也起着重要的作用。,五种主要类型的组蛋白,类 型,赖氨酸,精氨酸,氨基酸数,相对分子质量,(,道尔顿,),H1,29%,1%,215,23,000,H2A,11%,9%,129,14,000,H2B,16%,6%,125,13,800,H3,10%,13%,135,15,300,H4,11%,14%,102,11,200,组蛋白尾部的修饰,在,5,种组蛋白中,除,H1,的,N,末端富含疏水氨基酸,C,末端富含碱性氨基酸之外,其余,4,种都是,N,末端富含碱性氨基酸,(,如精氨酸,赖氨酸,),C,末端富含疏水氨基酸,(,如缬氨酸,异亮氨酸,),在形成聚合体的过程中,组蛋白,H2AH2BH3 H4,的,C,端的疏水氨基酸相互结合,而,N,端的碱性氨基酸则向四面伸出,以便与,DNA,分子相互作用,伸出的碱性氨基酸就是,“,组蛋白的尾巴,”,其中,H4,具有最长的尾部,H1,与,DNA,分子结合,锁住了核小体的进出口,使,DNA,分子的结构更加致密,组蛋白尾部形成的空间结构约占整个组蛋白多聚体的,25 %,30 %,从而为蛋白质或,DNA,的相互作用提供了开放的表面,组蛋白的尾部可以与核小体或连接,DNA,相互作用,使核小体间发生蛋白,-,蛋白或蛋白,-DNA,相互作用,或与非核小体蛋白,甚至与自身相互作用,组蛋白的球形部和尾部都会发生翻译后修饰,但由于其尾部暴露在核小体之外,容易受酶如乙酰化酶,甲基化酶和激酶等的作用而更容易发生,是主要的翻译后修饰部位,在组蛋白尾部区域常发生的翻译后修饰包括,:,乙酰化,磷酸化,甲基化,泛素化以及,ADP,核糖基化等,乙酰化修饰,乙酰化是最早被发现的与转录有关的组蛋白修饰方式,乙酰化由组蛋白乙酰基转移酶,HAT ( histone acetyl transferase ),催化,去乙酰化由组蛋白去乙酰基酶,HDAC ( histone deacetyl transferase),催化,乙酰化主要发生在组蛋白,H3,和,H4,的尾部比较保守的赖氨酸,(Lys),残基上,使其,氨基发生乙酰化,主要的乙酰化位点包括,H3,的,9 14 18,和,23,位的赖氨酸,H4,的,5812,和,16,位的赖氨酸等,组蛋白乙酰化,/,去乙酰化作用参与了真核基因组整体表达水平的调控,;,组蛋白乙酰转移酶,组蛋白去乙酰化酶等组蛋白修饰酶的一个非常重要的,甚至是最主要的功能是通过造成基因组水平迅速的乙酰化 去乙酰化循环实现基因组整体水平的调控,基因组具备较低的基础乙酰化水平有两个明显的好处,:(1),方便地开启或关闭基因转录,;(2),实现包括基因组水平上复制和,DNA,损伤修复在内的整体调控,组蛋白乙酰化,/,去乙酰化与基因表达调控,人们很早就发现组蛋白乙酰化与基因活化有关,而去乙酰化与基因沉默有关,目前认为组蛋白乙酰化,/,去乙酰化主要通过以下几种方式影响基因的表达,一是组蛋白乙酰化,/,去乙酰化改变核小体周围环境,加强或削弱基因表达相关蛋白质与,DNA,的相互作用,;,二是组蛋白乙酰化,/,去乙酰化参与染色质构型改变,进而影响蛋白质与蛋白质,蛋白质与,DNA,的相互作用,;,三是组蛋白乙酰化,/,去乙酰化作为特殊信号,被其它蛋白质因子识别并影响它们的活动,从而实现对基因表达的调控,Model of a histone deacetylase complex,组蛋白去乙酰化酶与癌症,HDAC,缺陷也可导致与致癌相关的表型，当,HDAC,过量或,HAT,的数量减少时，组蛋白乙酰化的平衡将偏向去乙酰化，从而导致基因表达的调节异常。在白血病中，几种转录因子由于异常招募,(recruit)HDAC,而抑制特定基因的表达。,例如，来源于急性前髓细胞白血病,(APL),患者的细胞系中有,HDAC,活性异常招募的现象。在,APL,患者中由于易位产生的融合癌基因产物通过招募,HDAC,而抑制转录。,APL,是急性骨髓白血病,(AML),的一种普通形式。在骨髓的前髓细胞阶段积累骨髓前体导致白细胞增多和出血。,HDAC,抑制剂分为六大类，其中丁酸和制滴菌素,(TSA),有着广泛的应用。丁酸是第一个被验证的,HDAC,抑制剂，已被成功地应用于癌症治疗的实验性研究，并有一定的疗效，但它发挥作用所需浓度较大，另外半衰期较短，因此它的应用受到很大的限制。,而另一类应用广泛的抑制剂为氧肟酸类，如,TSA,和,SAHA,，它们的特异性较强，所需浓度较低，因此应用较广。已有几种抑制剂进行了,期和,期临床试验，包括丁酸,SAHAMS 275CI 9942-,丙基戊酸,proxamide,和缩肽。,用,HDAC,抑制剂对几种类型的白血病和实体瘤进行治疗，效果非常好，很少或没有副作用,.,这说明与传统的化疗药物相比，,HDAC,抑制剂具有较大的优势和更加广泛的应用前景。,第四节,蛋白质的前体加工,原核生物中肽链起始合成时，,N,端为甲酰甲硫氨酸，真核肽链合成时,N,端是甲硫氨酸，但是成熟的蛋白质中,N,端并无甲酰甲硫氨酸，大多数蛋自质的,N,端也不是甲硫氨酸。,在生物合成过程中新生的肽链,N,端由去甲酞基酶去除甲酰甲硫氨酸残基的甲酰基，氨肽酶去除,N,端甲硫氨酸或,N,端某些氨基酸残基。,一些分泌性蛋白质、激素及酶最初合成的是不具有生物活性的前体，如白蛋白原、胰岛素原等。蛋白质前体要经过蛋白酶切割，去除一部分肽段后才具有活性。,它可以分为两种类型：蛋白质前体在细胞内被加工成有生物活性的蛋白质，然后分泌到胞外；蛋白质前体被分泌到胞外或消化道，被蛋白酶加工成有生物活性的蛋白质，如前胶原分子活化为胶原分子，胰蛋白酶原激活等。,蛋白质前体的加工,在哺乳动物细胞中有一大类内切蛋白酶如弗林蛋白酶,(furin),，前激素转换酶,PC1,、,PC2,和,PC3,等。它们能识别蛋白质前体中,ArgArg,、,LysArg,、,LysLys,等双碱性氨基酸残基序列。在该序列的,C,端切断肽链，此外还可能伴有其他酶切除蛋白质前体两末端的一些氨基酸残基。,蛋白质前体通过这种方式加工成有生物活性的蛋白质。内切蛋白酶的功能相同，但有不同的分工。弗林蛋白酶分布在各种类型的细胞中，负责组成型表达的蛋白质前体加工，例如白蛋白前体被它切割，去除,N,端肽段后成为白蛋白。前激素转移酶,PC,则负责分泌受调控的激素前体切割，如胰岛素原的加工。,Structures of Furin and Kexin,Kex2 protease,1,，多蛋白的加工,哺乳动物体内的多肽激素及神经肽生物合成时常被合成在一个包含有一种或多种多肽激素的多个拷贝的大前体中。该大前体称为多蛋白，例如前阿片促黑皮质素（,POMC,）前脑啡肽等。它们被内切蛋白酶加工成成熟的多肽激素。,在不同的组织中相同的多蛋白可被加工成不同的多肽激素，呈现组织特异性，例如,POMC,在垂体前叶中被加工成,ACTH,相,-,促脂解素,(,-LPH),，在垂体中间叶中被加工成,-,和,-,促黑素（,-MSH,，,-MSH,）、中间叶促皮质样肽、,-,促脂解素和,-,内啡肽。,这些肽类激素的分子量比较小，如若单独表达既不容易又不经济。生物体通过多蛋白加工的方式表达低分子量激素和神经肽可提高表达效率。,2,，胰岛素原的加工,胰岛素是胰岛,P,细胞分泌的一种激素。在生物合成过程中有,N,端信号肽的合成，跨膜转运，信号肋的切除，二硫键的形成与重排，在内质网胶中正确折叠成胰岛素原等过程。,胰岛素原只有一条肽链，在分泌小泡中被,PC2,和,PC3,切割，去除中间的肽段,(C,肽,),产生,A,链与,B,链，两者由,2,个二硫键相连。,B,链,C,端被羧肽酶加工，切除,2,个精氨酸残基，形成成熟的胰岛素。,为何胰岛素生物合成先是合成胰岛素原，然后再加工成胰岛素,?,实验证明胰岛素肽链的正确折叠依赖于,C,肽链中包含的信息，因此，成熟胰岛素的形成必须经过胰岛素原阶段。,其次胰岛素分泌是受调控的，胰岛素原的加工由,PC2,和,PC3,负责，可能是调控胰岛素分泌的环节。,3,，血管紧张素,II,的来源,肾脏是由无数个,“,肾单位,”,组成的，每个,“,肾单位,”,又由肾小球和肾小管组成，肾小球有入球小动脉和出球小动脉。,在肾小球入球动脉的特殊细胞（医学上称球旁细胞）分泌肾素；肾素可使肝脏合成的血管紧张素原生成血管紧张素,I,；血管紧张素,I,在一个特殊酶的作用下转变成血管紧张素,II,。,血管紧张素,II,是体内一个活性很强的物质，其作用包括三方面：,第一，使小动脉平滑肌收缩，外周血管阻力增加。,第二，刺激肾上腺一个叫皮质球状带的部位分泌醛固酮，醛固酮是保钠保水的物质，继而引起血容量增加，以上两方面的作用共称为肾素,-,血管紧张素,-,醛固酮系统。,第三，兴奋交感神经系统，使去甲肾上腺素分泌增加，使血管收缩。,以上三方面作用导致血压升高。再通过复杂的变化，血管紧张素,II,变成血管紧张素,III,，并使生物活性作用减弱或消失。,肾素是一种蛋白水解酶，可水解血中血管紧张素原,(,分子量为,60000,的,2,球蛋白,),，使,Lue,10,Val,11l,肽键断裂，成为血管紧张素,I(Angiotensin l),，这是一种没有生理活性的十肽，再在血管紧张素转化酶,(Angiotensin Converting Enzyne,，,ACE),作用下，脱去二肽，转为八肽，即血管紧张素,II (Angiotensin II),，是一种很强的血管收缩剂，使血压升高。,于是,ACE,就成为研究的靶酶。通过对该酶的抑制，使血管紧张素,I,不能转成血管紧张素,II,，血压便能保持正常，因而构成了一类抑制,ACE,的抗高血压药。,4,，肿瘤坏死因子,-,肿瘤坏死因子,-,（,TNF-,）是近年来研究较深入，应用较广泛的一种新型细胞因子。肿瘤坏死因子主要由活化的单核一巨噬细胞和,T,淋巴细胞产生。由前者产生的为肿瘤坏死因子,，后者产生的为肿瘤坏死因子,。,二者的作用和结构大同小异。由于它能杀死恶性肿瘤细胞，科学家们对其产生和生物学作用进行了大量的研究。,TNF-,的生物活性部分是蛋白质，含糖量极微或不含糖。,TNF-,的分子量和含糖量随动物种系不同而异。人的,TNF-,是由,3,个分子量为,17,000,的单体构成，单体呈,片层结构，他们之间通过一个二硫键共价组成活性复合体。不同种属动物来源的,TNF-,，在蛋白质组成的一级结构上具有极高的同源性。,TNF-,是具有多种生物学效应的一种细胞因子。,TNF-,不仅对肿瘤细胞有细胞毒,/,细胞溶解、抑制增殖等作用，还影响许多类型细胞包括心肌细胞的生长、分化；作用于血管内皮细胞，导致血管损伤和血栓形成。,另外，还能诱导心脏手术体外循环中的炎症反应，并与心功能不全、肺水肿等临床症状密切相关，在免疫,-,炎症协调的信号网络调节中起重要作用。,人,TNF-,前体由,233,个氨基酸残基组成，含,76,个氨基酸残基的信号肽，切除信号肽后成熟型,TNF -,为,157,氨基酸残基，非糖基化，第,69,位和,101,位两个半胱氨酸形成分子内二硫键。,小鼠,TNF-,前体为,235,氨基酸残基，信号肽,79,氨基酸残基，成熟的小鼠,TNF-,分子量为,17kda,，由,156,个氨基酸残基组成，第,69,位和,100,位两个半胱氨酸形成分子内二硫键，有一个糖基化点，但糖基化不影响其生物学功能。,最近有人报道通过基因工程技术表达了,n,端少,2,个氨基酸（,val,、,arg,）的,155,氨基酸人,TNF -,，具有更好的生物学活性和抗肿瘤效应。,肿瘤坏死因子,转化酶,(TACE),TACE,为一含锌的内肽金属蛋白酶,其多肽序列与,(,嵌于细胞膜表面的蛇毒金属蛋白酶家族,),和,(,基质金属蛋白酶家族,),有些相似,尤其是的多肽折叠和含锌的催化区环境与蛇毒金属蛋白酶相似,故被归类为哺乳类家族中的新成员,其生理催化功能以前未曾鉴定。,Models for actions of ADAM proteases.,5,，前内皮素原的加工,内皮素,(ET),是自,80,年代以来发现的最强的缩血管生物活性肽,前内皮素原由,203,个氨基酸组成,被内肽酶水解为,38,个,(,人,),或,39,个,(,猪,),氨基酸组成的中间产物大,ET(bigendothelin),后者再由内皮素转换酶,(ECE),加工形成由,21,个氨基酸组成的成熟,ET,即体内有活性的,ET,。,ECE,是其生物合成过程中的关键酶,在调节体内,ET,生物学活性上起极重要的作用。肺循环血管平滑肌上含有大量高亲和力的,ET,受体,而,ECE,分布与,ET,受体的分布具有平行关系,故,ET,及,ECE,对肺循环血液动力学有着不可忽视的影响。,酸性内皮素转换酶,在猪的主动脉内皮细胞内存在有一种酸性,ECE,其转换活性的最适,pH,值为,4.0,。在牛主动脉内皮细胞中存在有两种,ECE,其最适,pH,值分别为,3.0,和,7.0,。,pH,值为,3.0,的,ECE,是一种酸性,ECE,该酶活性可被酸性蛋白酶抑制剂抑胃肽,A,完全抑制,而不被其它抑制剂包括,Phosphoramidon,、苯甲基磺酰氟,(PMSF),、白胃素,(Leupeptin),、,E-64,、,N-,乙基顺丁烯二酰亚胺,(N-ethylomaleimide),、卡托普利,(Captopril),、抗蛋白酶肽,(Aprotinin),及乙二胺四乙酸,(EDTA),所抑制。它能特异地水解大,ET-1,的,Trp21-Val22,肽键,使其转化形成,ET-1,和大,ET-1,的,C,末端片段,而不产生任何其它降解产物。,中性内皮素转换酶,在牛主动脉内皮细胞中存有的两种,ECE,。当,pH7.0,时,ECE,的转换产物仅有,ET-1,及大,ET-1,的,C,末端片段,其转换活性不被其它蛋白酶抑制剂所抑制,但能被金属离子络合剂,ED-TA,抑制,表明此种转化活性可能由一种依赖金属离子的内肽酶所引起。,在牛颈动脉内皮细胞的,ECE,可特异地水解大,ET-1,使转化为,ET-1,其转化活性可被中性金属蛋白酶抑制剂,Phosphoramidon,所抑制,但不被另一金属内肽酶抑制剂,Thiophan,和血管紧张素转换酶抑制剂,Captopril,抑制。,ET,对肺循环血液动力学发挥了重要影响。抑制,ET,的生物学效应对于缓解肺血管阻力,减轻肺动脉高压实属必要。,每一种抑制剂对,ECE,的抑制强度、剂量关系、代谢途径以及它们之间的相互作用尚不清楚。故寻求一种能抑制,ET,转化酶活性进而阻止,ET,生物学效应的抑制剂,将为今后临床预防肺血管疾病的发生及治疗开拓新的前景。,6,，胰升血糖素样肽,GLP-,是一种正常人口服或静脉注射葡萄糖后能增加胰岛素分泌的一种生理性肽类肠道激素,-,肠促胰岛素,(Incretin),其肠促胰岛素作用依赖于血浆葡萄糖浓度，且口服葡萄糖诱导胰岛素分泌强度高于静脉注射,除了增加胰岛素的分泌外，还有降低胰升血糖素浓度,减慢胃排空,刺激胰岛素原的生物合成,减少食物吸收及提高胰岛素敏感性的作用,是一种,2,型,DM,治疗的新途径,结构,GLP-,的前体是由,160,个氨基酸残基组成的胰升血糖素原，在胰岛,A,细胞内被酶解为含有,29,个氨基酸残基的胰升血糖素，而在肠粘膜的,L-,细胞内被酶解为含,69,个残基的肠高血糖素,35,个残基的,GLP ,及,37,个残基的,GLP (1-37),GLP (1-37),无活性，需进一步水解切除,6,个氨基酸，成为具有生物活性的,GLP (7-37);,其中一部份分子,C-,端的一个氨基酸被分解，余端被酰胺化为具有生物活性的,GLP (7-36),酰胺，后者是,GLP ,的主要的天然肽，占,80%,Processing,GLP ,的分泌,GLP ,主要由回肠末端,结肠和直肠中的神经内分泌,L-,细胞分泌,肠腔内营养物质包括葡萄糖及脂肪等，它们可直接刺激,GLP ,的分泌，在进食葡萄糖,脂肪,氨基酸及混合食物后迅速释放,人,GLP (7-36),酰胺的空腹血浆浓度为,7 01 0pmol/L,，,GLP (7-37),为,6 01 0pmol,进食混合食物后几分钟即明显升高，可由,1 0,10 0pmol/L,升高到,20 0,50 0pmol/L,，,15,30,分钟达峰值，,60,分钟后回到基础水平,这种浓度足以使,GLP-I,产生明显的生理作用,GLP 1,被认为是增强胰岛素分泌作用最强的肠促胰岛素，其促胰岛素分泌的机制是结合胰岛,细胞,G,蛋白耦联受体，使,细胞内,cAMP,浓度升高，增加细胞内钙浓度，从而增强胰岛素的出胞作用,GLP 1,在体内迅速被二肽基肽酶,(DPP ),降解而失去生物活性，其半衰期不足,2,分钟,主要过程是氨基端倒数第二位丙氨酸位置被剪切，由,GLP 1(7 -36),酰胺形成,GLP 1(9-36),酰胺,因为,GLP 1(9-36),酰胺的代谢速率相对较慢，所以其是餐后血浆中,GLP 1,代谢物的主要形式，,GLP 1(9-36),酰胺也可结合,GLP 1,受体，但亲和力低于,GLP 1,