基因工程重组体克隆的筛选和鉴定

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第七章,重组体克隆的筛选和鉴定,一、抗药性标记及其插入失活选择法,pBR322,质粒上有两个抗菌素抗性基因,:,Tet,r,和,Amp,r,。,Tet,r,上有插入位点,BamH I,和,Sal I;,Amp,r,上有插入位点,Pst I,。,第一节,载体表型选择法,1.,原理：,pBR322,（,1,）四环素：,（,2,）氨苄青霉素抗性基因：,2. pBR322,抗菌素标记选择,产生,-,内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘,-,青霉素指示液（,I,2,-KI-Aampicillin,）（蓝灰色）褪色。,抑制细菌生长，但不杀死细菌。,杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,（,3,）环丝氨酸：,3.,选择过程：,如果在,Tet,r,上插入外源,DNA,，导致四环素抗性基因失活，可用,四环素加环丝氨酸,平板培养基选择重组克隆。,Tet,r,失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；,Tet,r,不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,（,1,）四环素抗性插入失活,无环丝氨酸培养基,（,2,）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,蓝色 碘没有消耗 青霉素没降解 阳性克隆,抗药性标记选择应注意的问题,抗药性标记选择如果用药物直接筛选，观察和确定,转化子菌落的培养时间不宜过长，以1216小时为宜，否则会出现假阳性转化子菌落。因为转化子菌落会降解选择药物，导致非阳性转化子菌落周围选择药物浓度降低。,二、,-,半乳糖苷酶显色反应选择法,-,半乳糖苷酶,乳糖,半乳糖,葡萄糖,Xgal,半乳糖,5-,溴,-4-,氯靛蓝,+,+,深蓝色,1.,原理：,载体,上有一段,-,半乳糖苷酶基因（,Lac Z,）的,片段（氨基端），其上有外源,DNA,的插入位点。,受体菌基因组,中有突变的,-,半乳糖苷酶基因（,片段缺失）。可以被,IPTG,诱导表达。 载体和受体菌基因组可以,互补,形成完整有功能的,-,半乳糖苷酶。,2.,选择过程,-,半乳糖苷酶使,Xgal,分解成兰色产物。,利用插入的外源基因的,表达产物,特性进行直接选择。（只在特定条件下）。,转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。,一、原理：,第二节,根据插入基因的表型选择,1.,弥补缺陷,his,-,his,+,受体菌：,外源基因：,在不含组氨酸的培养基中生长,小鼠的,二轻叶酸还原酶,（,DHFR,）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。,DHFR,载体,连接,转化受体菌,三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板,含,DHFR,的克隆才能生长,例：,使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,2.,增加新性状,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,一、直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,第三节,DNA,电泳检测法,分子量,Marker,载体,重组克隆,二、酶切电泳筛选法,1.,原理：,根据已知的外源,DNA,序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（,DNA,带数和长度）。,或用合适的内切酶切下插入片段，再用其它酶切这个片段，电泳后比较结果是否符合预计的结果。,A,B,A,或,B,不同克隆的酶切结果,插入片段,三、,PCR,扩增检测法,1.,原理,PCR,能在模板序列上扩增出预期,DNA,片段。,2.,过程,（,1,）从重组克隆中提取质粒（或,DNA,）。,（,2,）用外源,DNA,插入片段引物作,PCR,。,（,3,）电泳,PCR,产物。,（,4,）检查是否有,PCR,产物。,（,5,）,PCR,产物的长度是否与外源基因一致。,1.,核酸,杂交,第四节,核酸杂交检测法,一、原理：,重组克隆与探针杂交。,3.,识别标记,32,P,或,125,I,。,（,1,）放射性同位素,2.,检测用的探针,与外源,DNA,插入片段互补的序列。,（,2,）非放射性标记,荧光素,二、核酸杂交检测方法,用,DNA,（或,RNA,）探针检测,DNA,样品。,1. Southern blotting,从宿主细胞中提取,DNA,（或质粒载体），再用探针杂交。,只有带有插入片段的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。,酶切前,酶切后,插入片段,载体含,插入片段,插入片段探针杂交结果,Southern blot,筛选结果,（,1,）原位杂交筛选,特点：,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,（,2,）,R-,环检测法,DNA-RNA,杂交。,2,）原理：,3,）选择过程,在,70%,甲酰胺中，把,DNA,双链变性，复性的时候，,DNA-RNA,杂交分子比,DNA-DNA,双链更稳定。电镜下可见,R-,环形结构。,用外源基因的,mRNA,与重组载体杂交。,1,）R-环：,R-环：是指RNA通过取代与其序列一致的DNA链而与双链DNA杂交，被取代的DNA单链与RNA-DNA杂交双链所形成的环状结构。,缺点：需要电镜！,2. Northern blotting,用,DNA,（或,RNA,）探针检测,RNA,样品。,主要检测插入片段是否被转录。,从宿主细胞中提取,RNA,，再用探针杂交。,利用抗体作为,“,探针,”,来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：,一、放射性抗体检测法,第五节,免疫化学检测法,1.,抗体与产物的结合方式,对表达产物的检测。,蛋白,蛋白,“,杂交,”,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,125,I,标记的二,抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因,产物蛋白,一抗,125,I,标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因,产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,125,I,标记的二抗,结合蛋白,125,I,标记的二抗,2.,放射性抗体检测法过程,3. Broome-Gilbert,双位点检测法,质粒基因,A,插入基因,B,表达,质粒蛋白,A,外源蛋白,B,融合蛋白,检测融合蛋白。,既检测外源基因产物又检测载体基因产物。,固相支,持滤膜,抗,A,抗体,125,I,标记的,抗,B,抗体,质粒蛋白,A,外源蛋白,B,质粒蛋白,A,外源蛋白,B,固相支,持滤膜,抗,A,抗体,发光，底片曝光,二、免疫沉淀检测法,把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成,“,沉淀圈,”,。,1.,原理,抗原,抗体 凝集反应。,检测分泌型产物。,2.,方法,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,三、酶联免疫吸附测定（,ELISA,）,E,nzyme-,l,inked,i,mmuno,s,orbant,(,免疫吸收剂),a,ssay,1.,原理：,一抗（,primary antibody,）,:,与目标分子的特异结合。,二抗（,secondary antibody,）：,与一抗的特异性结合。,酶连（,enzyme-linke,）,：,二抗上携带一种酶,能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,2. ELISA,检测的一般步骤,（,1,）固定样品,将待测样品加入,96,孔微量滴定板（,microtiter plate,）的孔中，干燥后就被固定在,孔底,。,孔底,加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。,（,2,）一抗结合,一抗,加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。,二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。,（,3,）二抗结合,二抗,加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。,（,4,）显色反应,在特殊的分光光度仪（,酶标仪,）上比色，打印出结果。,（,5,）比色,3.ELISA,的局限性,有效，但准确性稍差（,主要取决于一抗的特异性,）。,必须与其他方法一起综合考虑。,最好用,单克隆抗体,（,monoclonal antibody,）:由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。,临床检验常用的单抗,四、免疫印迹（,western blotting,）法,1.,原理：,在蛋白质凝胶电泳以后，用,转膜和免疫,的方法检测胶上的蛋白质泳带。,（,1,）,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质,维持线性状态,，并与蛋白质结合，使蛋白质,带上负电荷,。,SDS:,（,SDS-PAGE,）：,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE,）：,（,P,oly,a,crylamide,g,el,e,lectrophoresis,）,在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，,移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短）,，从而把不同分子量的肽链分开。,电泳,buffer,电泳,buffer,点样,电泳方向,蛋白质电泳的分子量标准,已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。,商品化供应,Da,道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。,一克约为610,23,道尔顿,Dalton,凝胶中的蛋白质染色：,考马斯亮蓝：,灵敏度低、只能检出,0.3-1,g/,带，但可褪色回收。,硝酸银：,灵敏度高、可检出,2-5,n,g/,带。,2,）转到膜上进行染色。,1,）直接染色,直接染色电泳结果,（,2,）,Western blotting,电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、,PVDF,膜、中性尼龙膜等）。,Western,（转膜）,胶里的蛋白质带在电场的作用下,横向,转移到正极一侧的膜上。,膜,胶,蛋白,Western,装置,Blotting,原理与,ELISA,相同。,待测蛋白,硝酸纤,维素膜,一抗,二抗,辣根过氧,化物酶,底物,产物，,并发出光,PAGE,胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧化物酶：HRPO,1,）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与,膜上的蛋白结合。,2,）洗去未结合的一抗。,3,）用二抗与一抗结合（,二抗上带有,HRPO,）。,4,）清洗掉未结合的二抗。,5,）用,HRPO,的底物浸泡膜。,6,）暗室里曝光，冲洗胶片。,Blotting,过程,结果,单抗,blotting,结果,一、无细胞翻译系统,第六节,转译筛选法,能把外源的,mRNA,翻译成蛋白质的细胞提取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。,借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。,适用于mRNA转录丰度高的外源基因。,二、转译筛选,mRNA,无细胞翻译系统,35,S,标记的,甲硫氨酸,翻译,35,S,标记的肽链,PAGE,电泳,放射自显影,比较放射性,带纹的位置,载体,+,外源,DNA,转录,与预期的产物分子量相符？,三、杂交抑制转译法,mRNA,一旦与,DNA,杂交成,RNA-DNA,双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。,单链,mRNA,核糖体,小亚基,核糖体,大亚基,能翻译,mRNA,DNA,核糖体,小亚基,核糖体,大亚基,不能翻译,1.,原理,2.,过程,四、杂交释放转译法,1.,原理：,在高甲酰胺溶液中载体上克隆的,cDNA,与它的,mRNA,杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的,mRNA,，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。,2.,过程,硝酸纤,维素滤膜,载体和插,入的,cDNA,总,mRNA,cDNA,基因的,mRNA,杂交,洗脱,cDNA,基因的,mRNA,体外翻译,cDNA,编码的蛋白,电泳,凝胶放射自显影,cDNA,编,码的蛋白,硝酸纤,维素滤膜,载体和插,入的,cDNA,硝酸纤,维素滤膜,载体和插,入的,cDNA,收集,35,S,标记的氨基酸,专门设计检测能同,DNA,特异结合的蛋白质因子。,待测蛋白质,硝,酸,纤,维,素,滤,膜,能与蛋白质结,合的,DNA,序列,放射性标记,待测蛋白质,硝,酸,纤,维,素,滤,膜,能与蛋白质结,合的,DNA,序列,放射性标记,五、,DNA-,蛋白质相互作用筛选法,一般克隆与筛选策略,第七节,几种常用的,真核生物重组基因选择方法,真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。,二氢叶酸,四氢叶酸,二氢叶酸还原酶（,d,i,h,ydro,f,olate,r,eductase,，,DHFR,）,一、哺乳动物基因转移的选择标记,1.,胸苷激酶（,thymidine kinase, tk,）,（,1,）,TK,选择原理,四氢叶酸的必要性,DHFR,氨甲喋啉（,Methotrexate,）的抑制作用,氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断,dATP,、,dCTP,和,dTTP,的合成：,dUMP,dATP,TTP,dCTP,氨甲喋啉,抑制,抑制,胸苷酸激酶,的补救作用,TK,+,细胞,能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（,T,）合成d,TTP,，存活。,T,tk,次黄嘌呤,的补救作用,细胞可以利用次黄嘌呤合成,dATP,和,dCTP,。,dUMP,dATP,dTTP,dCTP,次黄嘌呤,补救,氨甲喋啉,抑制,抑制,HAT,培养基：,Tk,-,细胞株。,TK,基因。,宿主细胞,载体标记,（,2,）,TK,选择过程,含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷,的培养基。,(,h,ypoxanthine,，,a,minopterin,，,t,hiymidine,）,只有转入,TK,基因的细胞才能生存。,真核细胞核苷酸的合成需要,四氢叶酸,提供甲基。,2.,二氢叶酸还原酶基因（,DHFR,）,（,1,）,选择原理,二氢叶酸还原酶的必要性,dUMP,dATP,TTP,dCTP,四氢叶酸,四氢叶酸,DHFR,+,细胞,二氢叶酸,四氢叶酸,二氢叶酸还原酶,二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸,DHFR,+,细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。,能在,无胸腺嘧啶和次黄嘌呤,的培养基中生存,不需要补救！,DHFR,-,细胞,DHFR,-,细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。,需要补救！,不能在无,胸腺嘧啶和次黄嘌呤,的培养基中生存。,胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救,dUMP,dATP,TTP,dATP,次黄嘌呤,补救,胸苷,补救,无四氢叶酸提供甲基，,dNTP,合成受阻,时，,胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救,:,DHFR,-,细胞株（不能在,无核苷酸,的培养基中生长）。,宿主细胞,（,2,）选择过程,透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。,无核苷酸的培养基,需要,胸腺嘧啶和次黄嘌呤,补救！,氨甲喋呤,“,加压,”,添加少量氨甲喋啉抑制,内源性,DHFR,的补救作用，可提高选择。,DHFR,+,基因。,载体标记,只有转入,DHFR,+,基因的细胞才能生存。,DHFR,-,DHFR,-,DHFR,+,DHFR,+,live,die,无核苷酸的培养基,是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但,不影响真核生物,。,3.,新霉素抗性基因（,neo,r,）,（,1,）选择原理,新霉素（,neomycin,）,新霉素的类似物，是一种,氨基糖苷，对,真核细胞和原核细胞都有毒性,。,G418,（,geneticin,）, 新霉素抗性基因-,neo,r,细菌的新霉素抗性基因（,neo,r,）编码一种,磷酸转移酶（,APH,）,，能使,G418,失活。,G418,真核细胞,死亡,G418,存活,neo,r,真核细胞,含,致死剂量,G418,的完全培养基。,G418,培养基,真核细胞株均可。,neo,r,基因。,宿主细胞,载体标记,（,2,）选择过程,G418,：（,100-800,g/mL,）,CAT,是由大肠杆菌转座子,Tn9,编码的，催化,氯霉素发生乙酰化,失活。,氯霉素,cat,含氯霉素的完全培养基。,真核细胞株均可。,cat,基因。,乙酰氯霉素,4.,氯霉素乙酰转移酶（,CAT,）,（,1,）选择原理,（,2,）,选择条件,（,3,）,宿主细胞,（,4,）载体标记,c,hloramphenicol,a,cetyl,t,ransferase,在转化的细胞提取物中测定是否有,乙酰氯霉素。,（,5,）,CAT,分析方法,免疫学检查：,用抗,CAT,的血清进行,Western blot,或,ELISA,，检查,CAT,的表达。,Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen.,Other kits to assay for CAT protein,using ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemicals and Molecular Probes., 分析乙酰氯霉素,二、植物转化体报道基因筛选法,（1）,大肠杆菌的,-D-,葡萄糖醛酸糖苷酶,（,-D-,g,luc,u,ronida,s,e,，,GUS,）；,（2）,细菌和萤火虫的荧光素酶,（,luciferase,）；,（3）,水母绿色荧光蛋白（,GFP,）基因,（,G,reen,F,luorescent,P,rotein,）。,1.,报道基因（,reporter gene),（4）其它,2.,几种报道基因的作用原理,4-,甲,-,-D-,葡糖醛酸,荧光产物,-D-葡萄糖醛酸糖苷酶,GUS,水母绿色荧光蛋白,GFP,紫外光照,发绿色荧光,5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚,-,-D-,葡糖醛酸,蓝色水解产物,-D-葡萄糖醛酸糖苷酶,GUS,Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP,转入萤火虫的,luciferase,的烟草,植物细胞中适用的报道基因,酶活性,方法是否成熟,新霉素磷酸转移酶,成熟,潮霉素磷酸转移酶,成熟,二氢叶酸还原酶,成熟,氯霉素乙酰基转移酶,成熟,庆大霉素乙酰基转移酶,成熟,胭脂碱合成酶,成熟,章鱼碱合成酶,成熟,-D-葡萄糖醛酸糖苷酶,成熟,链霉素磷酸转移酶,成熟,萤火虫荧光素酶,成熟,细菌荧光素酶,成熟,苏氨酸脱氢酶,成熟,磷酸肌醇乙酰转移酶,成熟,乙酰乳酸合酶,不成熟,绿色荧光蛋白,成熟,