资源描述
,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验十一,组,组织,培,培养与病,毒,毒的细胞,感,感染法,练习内容,1鸡胚,纤,纤维母细,胞,胞培养法,（,（示教）,2病毒,的,的空斑形,成,成试验（,示,示教）,3致细,胞,胞病变作,用,用的观察,（,（示教）,目的要求,1了解,细,细胞培养,的,的原理与,方,方法,2了解,病,病毒空斑,形,形成试验,方,方法与意,义,义,3了解,病,病毒对细,胞,胞致病变,作,作用的类,型,型。,一、单层,细,细胞培养,法,法,（一）鸡,胚,胚纤维母,细,细胞培养,法,法,（二）人,胚,胚肾细胞,培,培养法,二、人双,倍,倍体细胞,培,培养法,双倍体细,胞,胞株，是,一,一种能在,体,体外分裂50代左,右,右而直,保,保持其双,倍,倍染色体,的,的单层细,胞,胞，,人,人双倍体,细,细胞来源,可,可以是人,胚,胚肺（4,个,个月以内,的,的胎儿）,或,或人胚肾,三、传代,细,细胞培养,法,法,传代细胞,系,系是一种,永,永远在体,外,外繁殖传,代,代的单屋,细,细胞。它,们,们通常来,源,源于癌细,胞,胞或由双,倍,倍体,细,细胞转化,而,而来，实,验,验室常用,从,从人瘤细,胞,胞建立起,来,来的传代,细,细胞如,Hela,细胞，,KB,细胞、,HEP2,细胞已广,泛,泛地应用,于,于病毒实,验,验。这些,传,传代细胞,系,系的最大,特,特点是通,过,过规律地,间,间 隔,传,传代，可,以,以无限制,地,地传下去,，,，如果将,它,它们悬浮,四、器官,培,培养,五、病毒,的,的细胞感,染,染法,在单层,细,细胞上,测,测定病毒,的,的方法有,多,多种，常,见,见的有病,毒,毒空斑形,成,成试验、,病,病毒空斑,形,形成抑制,试,试验.,六、细胞,致,致病作用,的,的观察,细胞致病,作,作用也称,“,“细胞病,变,变作用”,（,（,Cytopathic-effect，CPE），,根据病毒,和,和感染细,胞,胞的不同,，,，细胞病,变,变作用大,致,致上可以,分,分不同三,个,个类型。,（一）全,变,变型,指整个细,胞,胞都发生,改,改变，常,表,表现为（1）细胞,核,核及整个,细,细胞都发,生,生肿胀，,胞,胞浆呈颗,粒,粒样变性,、,、胞膜边,缘,缘不整齐,，,，或（2,）,）整个细,胞,胞发生碎,裂,裂、皱缩,、,、变圆、,脱,脱落。,（二）包,涵,涵体型,有的病毒,可,可在胞核,或,或胞浆内,形,形成包涵,体,体（见表133,）,）。,（三）融,合,合型,有的病毒,（,（如麻疹,病,病毒、单,纯,纯庖疹病,毒,毒等）可,使,使多数病,变,变细胞间,相,相互发生,融,融合而呈,“,“巨细胞,”,”（但各,个,个细胞的,胞,胞核仍可,分,分辨）。,【结果观,察,察】,纵观整个,单,单层细胞,，,，以下列,符,符号表示,其,其病变程,度,度：,（）,无,细,细胞病变,；,；,（+）,25以,下,下的细胞,有,有病变作,用,用；,（+）,一,一50的,细,细胞有病,变,变作用；,（+,）,）一75左,右,右的细胞,有,有病变作,用,用；,（+）一75以,上,上的细胞,有,有病变作,用,用；,某些病毒,引,引起细胞,病,病变的主,要,要特征(,表,表132),实验十四,病,病,毒,毒的血清,学,学试验,血清学试,验,验的方法,很,很多，一,股,股实验室,最,最常用的,是,是中和试,验,验，补体,结,结合试验,和,和红细胞,凝,凝集,及,及凝集抑,制,制试验。,近,近年来免,疫,疫荧光技,术,术、免疫,酶,酶联吸附,技,技术、间,接,接红细胞,凝,凝集试验,、,、琼,脂,脂扩散试,验,验以及红,细,细胞吸附,抑,抑制试验,等,等技术，,也,也成为实,验,验室病毒,诊,诊断的常,规,规技术。,练习内容,1病毒,的,的血球凝,集,集试验,2病毒,的,的血球撬,集,集抑制试,验,验,目的要求,1了解,病,病毒的血,清,清学试验,方,方法与原,理,理,2掌握,病,病毒的血,凝,凝试验和,血,血抑试验,的,的方法与,结,结果判读,血清学试,验,验是实验,室,室诊断病,毒,毒和鉴定,病,病毒的重,要,要手段，,也,也是研究,病,病毒的基,本,本方法之,一,一。,三、病毒,的,的血球凝,集,集与血球,凝,凝集抑制,试,试验,某些病毒,（,（如流感,病,病毒、副,流,流感病毒,、,、腮腺炎,病,病毒、脑,炎,炎病毒等,）,）能选择,性,性地凝集,个,个别动物,的,的红细胞,，,，这种现,象,象称为红,细,细胞凝集,现,现象，简,称,称血凝现,象,象，见表,玉,玉14一4。当这,些,些病毒与,相,相应的抗,体,体发生特,异,异性结合,后,后，失去,了,了与红细,胞,胞凝集的,能,能力，称,为,为红细胞,凝,凝集抑制,。,。红细胞,凝,凝集与红,细,细胞凝集,抑,抑制试验,比,比补体结,合,合试验操,作,作简单、,快,快速、节,约,约、并且,血,血凝抑制,试,试验具有,敏,敏感性高,，,，特异性,强,强的优点.这里,我,我们以新,鸡,鸡城瘟病,毒,毒,NDV,为例介绍,血,血凝和血,凝,凝抑制试,验,验。,【材料】,新城鸡瘟,病,病毒鸡胚,接,接种尿囊,液,液1份,0.5,鸡,鸡血球悬,液,液1管,生理盐水,或,或,PBS1,瓶,96孔微,量,量血清盘1,块,块,微量稀释,棒,棒1支,无菌试管1支,【方法】,1在微,量,量血清盘,的,的末孔标,记,记为对照,孔,孔。,2各孔,中,中加生理,盐,盐水25,微,微升。,3取病,毒,毒鸡胚尿,囊,囊液（经,离,离心）0.1毫升,加,加入无菌,试,试管，然,后,后加生理,盐,盐水0.9毫升（,即,即110稀释）,。,。,4取1,10病,毒,毒稀释液25微升,加,加入第1,孔,孔，再吸25微升,置,置2孔，,用,用微量稀,释,释棒捻转20次,依次稀,释,释，直至,第,第9孔弃,去,去25微,升,升。,5各孔,中,中加0.5鸡红,血,血球25,微,微升充分,摇,摇匀。,6置室,温,温经30,分,分钟，40分钟，1小时各,观,观察一次,结,结果。以45分钟,为,为准。,新城鸡瘟,病,病毒血凝,试,试验操作,顺,顺序(表14-5),25,25,25,25,25,25,25,25,孔 列,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,病毒稀,释度,110,120,140,180,1160,1320,1640,11280,12560,对照,生理盐水（,l）,25,25,110病毒悬液（,l）,25,25,25,25,25,25,25,25,25,弃去25,0.5%鸡红血球（,l）,25,25,25,25,25,25,25,25,25,25,摇匀后，置室温静止3050分钟,【结果判,读,读】,各孔出现,的,的血球凝,集,集程度以+、+、+、+、+、,表示。,+,为,为全部血,球,球发生凝,集,集，呈颗,粒,粒状薄膜,铺,铺于孔底,；,；,+约,有,有50,血,血球发生,凝,凝集；,+约有50血,球,球发生凝,集,集；,+约有25血球,发,发生凝集,；,；,不凝集,，,，表现为,血,血球沉于,孔,孔底，呈,一,一致密小,点,点，边缘,光,光滑，圆,润,润。,血凝试验,的,的结果以50血,球,球凝集（+）的,最,最高病毒,稀,稀释度为,试,试验的血,凝,凝滴度，,即,即为1个,血,血凝单位,。,。,血球凝集,抑,抑制试验,【材料】,除血球凝,集,集试验所,用,用材料外,，,，血清取,鸡,鸡免疫血,清,清。,【方法】,1血凝,素,素单位的,配,配制和调,配,配,2住微,量,量血清盘,上,上编号，,并,并设血清,对,对照、病,毒,毒（血凝,集,集）对照,和,和血球对,照,照孔然,后,后211孔中各,加,加生理盐,水,水或,PBS25,微升。,3将1,10血,清,清加入1,、,、2、9,孔,孔，并从,第,第2孔起,作,作一系列,倍,倍比稀释,至,至11280或,更,更高的稀,释,释度，每,孔,孔为25,微,微升。,4按操,作,作简表加,入,入4单位,血,血凝集。,6混匀,，,，在室温,下,下作用20分钟。,7各孔,中,中滴加0.596,鸡,鸡血血球,悬,悬液50,微,微升。,8在血,清,清对照、,病,病毒（血,凝,凝素）对,照,照，血球,对,对照孔中,滴,滴加生理,盐,盐水或,PBS,各25微,升,升。,9混匀,后,后，在室,温,温下静止,，,，30分,钟,钟，60,分,分钟各观,察,察一次结,果,果。一般,以,以60分,钟,钟结果为,准,准，但如,果,果血球下,滑,滑显著，,则,则以30,分,分钟结果,判,判读。,25,25,25,25,25,25,25,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,血清稀,释度,110,120,140,180,1160,1320,1640,11280,血清,对照,病毒,对照,血球对照,生理盐水（,l）,NS,25,50,稀释的血清（,l）,25,25,25,25,25,25,25,25,25,弃去,4单位血凝（,l）,25,25,25,25,25,25,25,25,25,摇匀后，置室温静止3050分钟,0.5%鸡红,血球（,l）,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,1根据,各,各孔血球,凝,凝集程度,，,，以“+、+、+、+,，,，”表,示,示。,2,查,查,看,看,各,各,对,对,照,照,孔,孔,：,：,血,血,清,清,对,对,照,照,不,不,凝,凝,集,集,（,（,）,）,：,：,病,病,毒,毒,对,对,照,照,为,为,完,完,全,全,凝,凝,集,集,（,（+,）,）,，,，,血,血,球,球,对,对,照,照,则,则,应,应,不,不,凝,凝,集,集,（,（,）,）,。,。,3,以,以,出,出,现,现,完,完,全,全,抑,抑,制,制,血,血,球,球,凝,凝,集,集,（,（,即,即,不,不,凝,凝,集,集,）,）,的,的,最,最,高,高,血,血,清,清,稀,稀,释,释,度,度,为,为,其,其,最,最,终,终,滴,滴,度,度,。,。,例,例,如,如,稀,释,释,倍,倍,数,数,：,：1,10,l,201,40l,801,1601,320l,6401,1280,结果,：,：,+,此,血,血,清,清,血,血,凝,凝,抑,抑,制,制,滴,滴,度,度,为,为1,160,，,，,结,结,果,果,判,判,读,读,】,】,实,验,验,十,十,五,五,病,病,毒,毒,的,的,快,快,速,速,诊,诊,断,断,目,的,的,要,要,求,求,1,初,初,步,步,掌,掌,握,握,电,电,镜,镜,下,下,病,病,毒,毒,的,的,基,基,本,本,形,形,态,态,2,了,了,解,解,ELISA,的,原,原,理,理,、,、,方,方,法,法,及,及,结,结,果,果,判,判,读,读,练,习,习,ELISA,酶,联,联,免,免,疫,疫,吸,吸,附,附,试,试,验,验,（,EnzymeLinkedimmunosorbentassay,，,，ELISA,）,）,ELISA,是,当,当,前,前,各,各,实,实,验,验,检,检,测,测,抗,抗,原,原,抗,抗,体,体,最,最,常,常,用,用,的,的,方,方,法,法,之,之,一,一,，,，,也,也,是,是,进,进,行,行,病,病,毒,毒,快,快,速,速,诊,诊,断,断,的,的,重,重,要,要,手,手,段,段,。,。,它,它,具,具,有,有,灵,灵,敏,敏,度,度,高,高,（,（10,9,一10,12,克,）,）,，,，,特,特,异,异,性,性,强,强,、,、,操,操,作,作,简,简,便,便,、,、,易,易,于,于,观,观,察,察,、,、,便,便,于,于,现,现,场,场,大,大,规,规,模,模,检,检,查,查,。,。,ELISA,的,的,种,种,类,类,有,有,许,许,多,多,种,种,，,，,但,但,用,用,于,于,病,病,毒,毒,快,快,速,速,诊,诊,
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