实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳,分子生物学实验,1,一 实验目的,通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。,自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如：,DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。,2,二 实验原理,DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。,核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电；pH8左右时，整个分子带负电。,在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。,可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA直线DNA开环的双链环状DNA。,3,二 实验原理,4,凝胶类型及浓度,分离,DNA,片段的大小范围（,bp,）,0.3%,琼脂糖,50 0001 000,0.7%,琼脂糖,20 0001 000,1.4%,琼脂糖,6 000300,4.0%,聚丙烯酰胺,1 000100,10.0%,聚丙烯酰胺,50025,20.0%,聚丙烯酰胺,501,凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。,5,DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为,0.250kb,之间,6,EB(溴化乙锭,),能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。,电泳时所需DNA样品量仅0.51,g.,EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。,EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。,在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光,7,三 实验步骤,称样,溶解,加热,制板,倒胶,取样,点样,电泳,检测,8,三 实验步骤,制胶,1.0 琼脂糖凝胶(50ml),凝胶板的制备,小心加入23lEB，摇匀（,污染EB吸头，不宜再回收使用,）,点样,样品10l，与4l溴酚兰混匀,电泳,60v，大约50-60min,观察和拍照,254nm紫外灯下观察,9,四 实验结果,五 注意事项,EB是一种诱变剂，操作时必须戴塑料或乳胶手套!,六 习 题,琼脂糖凝胶电泳的适用范围？,2.,影响琼脂糖凝胶电泳的因素有哪些？,4 泳道 maker,1 泳道 质粒DNA,2、3、5、6泳道 酶切产物,1 2 3 4 5 6,质粒,酶切片段,10,酶切片段,标准DNA/ECo130I,13929,7743,6223,3472,2690,1882,4ul,2ul,11,