酶学分析技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 酶学分析技术,本章内容概要：,第一节 酶活性测定的基本知识,第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型,第三节 同工酶测定,第四节 酶学分析在临床诊断上的应用,第五节 酶活性测定最适条件的选择,1,、,掌握,酶活性的国际单位定义，酶活性浓度的表示方法及酶活性单位的计算公式；酶活性测定的连续监测法和定时法的概念、区别和结果的计算方法；酶偶联反应的在酶活性测定和酶法分析代谢物中的应用；以,NAD,（,P,）,H,为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用,.,本章教学要求：,2,、,熟悉,酶促反应进程；酶促反应底物动力学；酶学分析在临床诊断上的应用。,3,、,了解,Km,值、,Vmax,值的应用及,Km,和,Vmax,的测定；同工酶测定和酶活性测定最适条件的选择。,第一节,酶活性测定的基本知识,酶活性的概念,酶活性单位,酶活性单位的计算,酶促反应进程,酶促反应底物动力学,一、酶活性的概念,酶活性,即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。,底物浓度为,S,产物浓度为,P,时间为,t,，反应速度为,v,v=-,dS/dt,或,v=,dP/dt,。,注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。,二、酶活性单位,定义：,指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。,惯用单位,：,酶活性测定方法的建立者所规定的单位。,国际单位,：,1IU,指在规定条件（最适,pH,，最适底物浓度）下，每分钟转化,1,mol,底物的酶量。单位为,IU/L,。,Katal,单位,：,1Katal,指在规定条件下，每秒钟转化,1mol,底物的,酶量，,1Katal=6010,6,IU,。,三、酶活性单位的计算,步骤：,运用公式进行计算。,明确测定方法的,酶单位定义,，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位，,计算公式,:,产物的增加量 每单位规定的保温时间,1000,（,ml,）,酶单位,/,升,=,每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（,ml,）,分光光度法测定的公式：,（,A,测定,A,对照）,V,总,10,6,每单位规定的保温时间,酶单位,/,升,=,LV,标 实际保温时间,四、酶促反应进程,酶促反应进程曲线,酶量的测定：,通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确测定酶量，应使酶浓度（,E,）与酶促反应速度成正比，即,E-,dS/dt,或,EdP/dt,。,能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。,酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。,酶的含量,酶活性,酶促反应初速度,五、酶促反应底物动力学,中间产物学说：,酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催,化底物反应生成产物。,E+S,ES E+P,米,-,曼氏方程：,VmaxS,v=,S+Km,上式中,v,代表反应速度，,Vmax,代表最大反应速度，,S,代表底物浓度，,Km,称为米氏常数。,（一）米氏常数的定义,由米,-,曼氏方程可以导出：,（,Vmax-v,）,S,Km=,v,当,v=1/2Vmax,时，,Km=S,。因此,Km,值为反应速度相当于,最大反应速度一半时的底物浓度。,Km,值是酶的特征常数,，具有重,要的应用价值。,（二）,Km,值的应用,1.,鉴定酶的种类,Km,值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与,酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。,不同种,类的酶其,Km,值不同，对于一种未知的酶，可在规定的,条件下测定其,Km,值加以鉴定。,表,7-1,某些酶的,Km,值,酶 底物,Km(mmol,/L),乳酸脱氢酶 丙酮酸,0.017,己糖激酶,D-,葡萄糖,0.05,D-,果糖,1.5,-,半乳糖苷酶,D-,乳糖,4.0,碳酸酐酶,H2CO3 9.0,过氧化氢酶,H2O2 25,蔗糖酶 蔗糖,28,糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸,108,2.,反映酶与底物的亲合力,Km,值越大，酶与底物亲合力越小，,Km,值越小，酶与底物亲合力越大。,3.,选择酶的最适底物,Km,值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底物有不同的,Km,值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，使酶促反应容易进行，并节省底物用量。,4.,计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最,大反应速度的比率,根据米,-,曼氏方程可以计算,5.,设计适宜的底物浓度,酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶,活性，一般要求初速度达到最大速度的,90%,95%,、底物,消耗率为,1%,5%,。这样既可以近似地表示酶活性，又不,致于使底物浓度过高而造成浪费。,(,三,),V,max,的应用,定义：,Vmax,指,酶完全被底物分子饱和时的反应速度。,应用：,Vmax,可用来计算酶的转化率（,TN,），即单位时间内每分子,酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数,/,秒。当反,应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的,转化率：,TN=,底物转化量（,mol/s,）,/,酶量（,mol,）,(,四,)K,m,和,V,max,的测定,1,Linweaver,-Burk,作图法,又称为双倒数作图法,1 Km+S Km 1 1,=+,v,VmaxS,Vmax,S,Vmax,2,Cornish-Bowden,作图法,又称为直线线性作图法。,第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型,酶活性的测定方法,工具酶,酶偶联测定法,底物浓度测定,一、酶活性的测定方法,按照,对酶促反应时间的选择,不同,连续监测法,固定时间法,（一）固定时间法,分类：,终点法：在反应进行到预定时间后要终止反应。,两点法：该方法反应时间的预定是从,t,1,t,2,。,定义：,测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。,特点：,优点,是简单,。,缺点,是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。,注意：,固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以,30,60,分钟为宜。,（二）连续监测法,原理：,定义：,测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。,该方法每隔一定时间（,10s,60s,）测定一次底物或产,物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图,，绘制反应速度曲线。,特点：,在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法,缺点：,要求高，要求能够精确地控制温度、,pH,值和底物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些要求。,优点,:,能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。,二、工具酶,定义：,偶联：,工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合。,工具酶：,将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶。,工具酶有,氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类,分类：,表,7-2,常用工具酶的名称及其缩写符号,名 称 缩写符号 名 称 缩写符号,乳酸脱氢酶,LDH,苹果酸脱氢酶,MDH,6-,磷酸葡萄糖脱氢酶,G6PD,谷氨酸脱氢酶,GLDH,葡萄糖氧化酶,GOD,胆固醇氧化酶,COD,磷酸甘油氧化酶,GPO,过氧化物酶,POD,己糖激酶,HK,肌酸激酶,CK,丙酮酸激酶,PK,甘油激酶,GK,脂蛋白脂肪酶,LPL,胆固醇酯酶,CE,脲酶,肌酐酶,三、酶偶联测定法,应用,：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应。,Ex Ea,Ei,A B C P,式中,A,为底物，,B,、,C,为中间产物，,P,为产物（必须能够直接测,定），,Ex,为待测酶，,Ea,、,Ei,都为工具酶。按照工具酶作用的不同，,Ea,又称为辅助酶，,Ei,又称为指示酶，,C P,称为指示反应。,（一）酶偶联反应的原理,在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期可以通过测定指示酶的,Km,和,Vmax,等动力学因数加以计算确定。,（二）常用指示酶及其指示反应,1,脱氢酶,用作工具酶的脱氢酶都是以,NAD(P)H,为辅酶的脱氢酶，例如,LDH,、,MDH,、,G6PD,、,GLDH,等，它们催化下列反应：,P+NAD(P)H+H,+,PH,2,+NAD(P),+,可对,NAD(P)H,在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定,应用：,ALT,、,AST,、,CK,等酶活性测定。,2,过氧化物酶,POD,可,催化过氧化氢与某些色原反应，例如与,4-,氨基安替比林（,4-AAP,）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：,POD,2H,2,O,2,+4-AAP+,酚 醌亚胺（红色）,+4H,2,O,Trinder,反应,：,应用,：,GOD,、,COD,、,GPO,、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与,POD,偶联，通过,Trinder,反应加以测定。,四、底物浓度测定,利用酶催化反应的高效率和专一性，可以测,定底物浓度。与酶活性测定类似。,第三节 同工酶测定,同工酶的定义,同工酶产生的机理,同工酶的测定方法,同工酶的定义,是催化功能相同，但是分子组成及理化性质不同,的一组酶，是在同一种属中由不同基因位点或等位,基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂多体。,一、同工酶产生的机理,（一）由不同基因位点编码,（二）由等位基因编码,（三）由多肽链化学修饰产生,二、同工酶的测定方法,（一）按照理化性质不同进行分离鉴定,1,电泳法,同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率,也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。,2,层析法,根据同工酶分子荷电量不同，可用离子交换层析法,加以分离。,（二）按照底物专一性不同进行鉴定,同工酶,底物专一性不同，,Km,值也不同。如果同工酶之间的,Km,值差别足够大，可以通过测定其,Km,值加以鉴定。,（三）按照,最适,pH,不同进行鉴定,同工酶,分子氨基酸组成不同，最适,pH,也不同。如果同工酶最适,pH,之间的差别足够大，可以通过调节缓冲溶液的,pH,值加以鉴定。,（四）按照免疫学特性不同进行分离鉴定,（五）按照耐热程度不同进行鉴定,（六）选择性抑制法,第四节 酶学分析在临床诊断上的应用,血浆酶的来源,酶的区域化分布,酶活性测定在临床诊断中的应用,同工酶的诊断价值,一、血浆酶的来源,血浆酶,血浆特异酶,非血浆特异酶,外分泌酶,细胞内酶,二、酶的区域化分布,表,7-3,诊断常用血清酶的来源,血清酶 符号 来源,鸟氨酸氨基甲酰转移酶,OCT,肝,卵磷脂胆固醇酰基转移酶,LCAT,肝,谷氨酸脱氢酶,GLDH,肝,山梨醇脱氢酶,SDH,肝,丙氨酸氨基转移酶,ALT,肝、肾、心,异柠檬酸脱氢酶,ICD,肝、胎盘、心,-,谷氨酰转肽酶 ,-GT,肝、胆、肾、小肠,5-,核苷酸酶,5-NT,肝、胆道,单胺氧化酶,MAO,肝、肾、脑,天门冬氨酸氨基转移酶,AST,心、肝、骨骼肌,肌酸激酶,CK,骨骼肌、心、脑,乳酸脱氢酶,LDH,心、肾、骨骼肌、肝、肺,碱性磷酸酶,ALP,小肠、胎盘、肝、肾,酸性磷酸酶,ACP,前列腺、红细胞、血小板,淀粉酶,AMS,胰、唾液腺,脂肪酶,LPS,胰,三、酶活性测定在临床诊断中的应用,（一）在肝脏疾病诊断中的应用,（二）在急性心肌梗死诊断中的应用,（三）在急性胰腺炎诊断中的应用,（四）在骨骼疾病诊断中的应用,（五）在肌肉疾病诊断中的应用,（六）在前列腺疾病诊断中的应用,（七）在肿瘤诊断中的应用,四、同工酶的诊断价值,第五节 酶活性测定最适条件的选择,（一）标本,（二）测定条件,底物浓度、酶浓度、温度、酸碱度、辅助因子、激活剂和抑制剂,