HIV基因的复制和逆转

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Doc.Huang,生化案例讨论,问题讨论？,HIV,基因组的复制过程？（参考章节：,DNA,的生物合成、,RNA,的生物合成）,逆转录如何导致,HIV,基因突变？,HIV,基因突变的生物学意义？（参考章节：,DNA,的生物合成）,首先了解下：,HIV,的基因组结构及功能,一、,HIV,的基因组结构及功能,HIV,基因组为,单股正链,RNA,二倍体,，每条,RNA,链长约,9.8kb,，两条链的,5,端借氢键形成二聚体。与其他逆转录病毒相同，,HIV,的基因结构从,5,端到,3,端依次为,5LTR-gag-pol-env-3LTR,。,5,端有帽状结构,m7G5ppp5GmpNp,，,3,端有,polyA,序列,。除,三个编码结构蛋白的基因,gag,、,pol,、,env,外，,HIV,还有较其他逆转录病毒更多的,调节基因,（,regulatory gene,）和,附加基因,(accessory gene),，其编码的的调节蛋白在病毒的整个感染及复制过程中具有非常重要的作用，目前已发现至少有,7,种：,tat,、,rev,、,nef,、,vpr,、,vpu,、,vpx,和,vif,。,1,长未端重复序列：,HIV,基因组两端的长未端重复序列（,long terminal repeat, LTR,）,不编码病毒产物,，对于病毒基因表达的起始和,调节,至关重要，其上有许多细胞转录因子的结合位点，可分为,调节单位,、,核心转录单位,和,反式激活效应元件单位（,TAR,）,三个不同的调控功能区。,2,Gag,基因：,gag,基因能编码约,500,个氨基酸组成的聚合前体蛋白，经蛋白酶水解形成,P17,，,P24,核蛋白，使,RNA,不受外界核酸酶破坏。,gag,基因编码几种病毒核心蛋白（衣壳蛋白）,3,Pol,基因：,Pol,基因编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶,H,，均为病毒增殖所必需。,pol,基因编码,3,种酶：反转录酶、蛋白酶和整合酶,4,Env,基因,env,基因编码约,863,个氨基酸的前体蛋白并糖基化成,gp160,，,gp120,和,gp41,。,gp120,含有中和抗原决定簇，已证明,HIV,中和抗原表位，在,gp120 V3,环上，,V3,环区是囊膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。,gp120,与跨膜蛋白,gp41,以非共价键相连。,gp41,与靶细胞融合，促使病毒进入细胞内。实验表明,gp41,亦有较强抗原性，能诱导产生抗体反应。,env,基因编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白。,其他调节基因和附加基因,5,TaT,基因,编码蛋白可与,LTR,结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒,mRNA,的翻译。,6,Rev,基因,产物是一种顺式激活因子，能对,env,和,gag,中顺式作用抑制序去抑制作用，增强,gag,和,env,基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白。,7,Nef,基因,编码蛋白,P27,对,HIV,基因的表达有负调控作用，以推迟病毒复制。该蛋白作用于,HIv cDNA,的,LTR,，抑制整合的病毒转录。可能是,HIV,在体内维持持续感集体所必需。,其他调节基因和附加基因,8,Vif,基因,对,HIV,并非必不可少，但可能影响游离,HIV,感染性、病毒体的产生和体内传播。,9,VPU,基因,为,HIV-1,所特有，对,HIV,的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少。,10,Vpr,基因,编码蛋白是一种弱的转录激活物，在体内繁殖周期中起一定作用。,二、,DNA,的反转录合成,（,Reverse transcription,）,中心法则：,RNA,DNA,逆转录,酶,逆转录病毒和逆转录酶,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,RNA,模板,逆转录酶,DNA,-RNA,杂化双链,RNA,酶,单链,DNA,逆转录酶,双链,DNA,反转录病毒：,RNA,病毒，含有反转录酶,反转录：,在反转录酶的作用下以,RNA,为模板合成,DNA,的过程。,反转录酶：,以,RNA,为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补,DNA,（,cDNA,）的酶,1,、反转录酶以,tRNA,为引物合成双链,cDNA,RNA,指导的,DNA,聚合酶活性；,DNA,指导的,DNA,聚合酶活性；,RNAse H,的活性（是指它能够从,5,3,和,3,5,两个方向水解,DNA-RNA,杂合分子中的,RNA,）。,然而：,反转录酶中不具有,35,外切酶活性，因此没有校正功能,反转录酶有,3,种酶的活性：,反转录酶的结构,2,、反转录病毒在宿主细胞内的主要活动,（一）,反转录合成双链,cDNA,（二）,双链,cDNA,插入宿主染色体形成原病毒,原病毒或前病毒：,存在于真核染色体中和反转录病毒,RNA,基因组相对应的双链,DNA,序列。,反转录病毒,RNA,基因组和原病毒,反转录病毒,RNA,基因组转变为双链,cDNA,的途径,问题,4,：,HIV,基因组的复制过程？,HIV,的复制,.swf,gag,基因,编码几种病毒核心蛋白（衣壳蛋白）,;,pol,基因,编码,3,种酶：反转录酶、蛋白酶和整合酶,;,env,基因,编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白。,3,、原病毒,DNA,转录产生病毒,RNA,具有自我复制能力的反转录病毒基因组含有,3,个基因：,直接翻译产生多蛋白,Gag,和,Gag-Pol,。,含有包装信号，因此构成完整的病毒基因组。,大约一半初级转录产物经过剪接加工形成,gag-pol,mRNA,和,env,mRNA,。,原病毒初级转录产物有,3,种重要功能：,初级转录产物多蛋白,Gag-Pol,，经过蛋白酶水解，可产生反转录酶、蛋白酶和整合酶。,多蛋白,Gag,经过加工，生成,4,种病毒衣壳蛋白。,env,基因编码的,Env,蛋白，经过加工以后插入病毒外膜磷脂双层。,这些病毒蛋白和病毒,RNA,基因组可以迅速组装成许多新的反转录病毒颗粒。,4,、病毒,RNA,经翻译和包装形成反转录病毒颗粒,简单地重温下,HIV,感染的过程,1,、吸附及穿入,HIV-1,感染人体后，病毒选择性的吸附于靶细胞的,CD 4,受体上，病毒包膜发生构象改变，外膜糖蛋白,gp120,的,V3,区与宿主细胞的,CCR5,或,CXCR4,结合，引起跨膜糖蛋白,gp41,区段,HIV-1,感染人体后，病毒选择性的吸附于靶细胞的,CD 4,受体上，病毒包膜发生构象改变，外膜糖蛋白,gp120,的,V3,区与宿主细胞的,CCR5,或,CXCR4,结合，引起跨膜糖蛋白,gp41,区段与靶细胞膜上的融合结 构域发生融合，使病毒核衣壳,穿入宿主细胞,。,与靶细胞膜上的融合结 构域发生融合，使病毒核衣壳,穿入宿主细胞,。,2,、脱衣壳和逆转录,病毒进入细胞后包裹在病毒衣壳内的病毒,RNA,，在与亲环素结合的衣壳蛋白,p24,的辅助下出胞。这一过程对环孢菌素,A,敏感。紧接着病毒,RNA,利用自身逆转酶的,RNA,依赖的,DNA,聚合酶和,RNA,酶活性进行逆转录，最后合成病毒基因组的双链,DNA,分子,(,cDNA,),。,3,、cDNA变为DNA,环化,cDNA,在,环化酶,的作用下形成以共价或非共价结合的双链环状,DNA,分子。其中非共价结合的环状,DNA,是整合到宿主染色体上的形式，抗病毒药对此无效。大多数新合成的病毒,DNA,以游离、非整合的共价结合的,环状,DNA,形式,保留在细胞浆内，它没有转录作用，但有致病理变化作用，抗病毒药对以这种形式存在的病毒有效， 可使病毒载量下降。,4,、转录出正链RNA,cDNA插入细胞基因组成为前病毒，然后以前病毒为模板，转录出正链RNA，即为病毒基因组。,问题,5,：,逆转录如何导致,HIV,基因突变？,HIV,基因突变的生物学意义？,一、,多种因素通过不同形式可引起,DNA,损伤,碱基开环和糖苷键断裂引起碱基丢失,辐射或氧化损伤等引起碱基改变,化学因素可引起核苷酸插入或缺失,辐射和化学损伤可引起,DNA,链断裂,物理和化学因素可引起,DNA,链间或链内交联,二、,DNA,损伤的结果,:,其一，导致复制或转录障碍,其二，导致复制后产生,基因突变,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为,突变,。,在复制过程中发生的,DNA,突变称为,DNA,损伤,(DNA damage),。,从分子水平来看，突变就是,DNA,分子上碱基的改变。,三、突变：,四、突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础,（二）突变导致基因型改变,（三）突变导致死亡,（四）突变是某些疾病的发病基础,五、,HIV,的高突变率：,HIV,的突变率极高，,基因组的点突变,每天都可发生，导致,HIV,频发表位突变。,HIV,为逆转录病毒，,反转录酶中不具有,35,外切酶活性，因此没有校正功能，,DNA,损伤修复能力较差，,所以由反转录酶催化合成的,DNA,出错率比较高，,因而,HIV,的变异频率非常高，每一轮复制都会引入约,10,个碱基的错误。,六、,HIV,基因突变的生物学意义,高的变异频率使世界不同地区甚至同一感染个体不同时期,HIV,的基因组都有较大差异，即产生许多,HIV,的,亚型,。,HIV,的亚型及分布,根据,HIV gag,和,env,区的基因序列，目前,HIV-1,可分为,M,、,N,和,O,三个进化组，两个进化组之间序列的异质性超过,45%,。依据,env,区序列，,M,组又可分为,A-J 10,个亚型，亚型之间序列的异质性为,30%,。,A,和,D,亚型主要见于中非；,B,亚型见于北美、欧洲、澳大利亚等；,C,亚型在南非、印度及中国；,E,亚型在中非、泰国及中国；,F,亚型在巴西和扎伊尔；,G,亚型在俄罗斯、台湾及加蓬；,H,亚型见于非洲；,I,亚型在塞浦路斯；,J,亚型在非洲。,O,组最初从喀麦隆分离而来，主要分布于喀麦隆、加蓬等国。,N,组为新近分离的一个组，其具体分布有待进一步调查。,关键词,DNA,的反转录合成,反转录病毒,反转录,反转录酶,DNA,损伤及修复,突变,谢谢大家！,