微生物的遗传变异ppt课件

第六章,第 七 章,微生物的遗传变异,第七章 微生物的遗传变异与育种,理想的工业发酵菌种应符合以下要求,遗传性状稳定；,生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；,目标产物的产量尽可能接近理论转化率；,目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离；,尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离；,培养基成分简单、来源广、价格低廉；,对温度、,pH,、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；,对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。,微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的,研究对象,。,对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了,现代分子生物学,和,生物工程学,的发展，而且为,育种工作,提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。,研究微生物遗传学的意义,一、遗传与变异的概念,遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。,遗传,(heredity),：,亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。,遗传型（,genotype,）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；,-,是一种内在可能性或潜力。,遗传型,+,环境条件 表型,表型（,phenotype,）：,指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和,;-,是一种,现实存在，,是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。,代谢,发育,概述,变异,(variation):,生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。变异的特点：,a.,在群体中以极低的几率出现，（一般为,10,-6,10,-10,）；,b.,形状变化的幅度大；,c.,变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。,例如：粘质沙雷氏菌：,在,25,下培养，产生深红色的灵杆菌素；在,37,下培养，不产生色素；如果重新将温度降到,25,，又恢复产色素的能力。,遗传与变异的概念,二、,遗传变异的物质基础,种质连续理论：,1883-1889,年间,Weissmann,提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。,基因学说：,1933,年摩尔根（,Thomas Hunt Morgan,）发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。,DNA,是遗传变异的物质基础的证明：,利用微生物为实验对象进行的三个著名实验的论证（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验），才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。,经典试验,1.,肺炎链球菌的转化试验,加,S,菌,DNA,加,S,菌,DNA,及,DNA,酶以外的酶,加,S,菌的,DNA,和,DNA,酶,加,S,菌的,RNA,加,S,菌的蛋白质,加,S,菌的荚膜多糖,活,R,菌,长出,S,菌,只有,R,菌,1944,年,O.T.Avery,、,C.M.MacLeod,和,M,。,McCarty,从热死,S,型,S. pneumoniae,中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：,只有,S,型细菌的,DNA,才能将,S. pneumoniae,的,R,型转化为,S,型。且,DNA,纯度越高，转化效率也越高。说明,S,型菌株转移给,R,型菌株的，是遗传因子。,分离后的,S,型细胞物质对,R,型细胞的转化,结论,细胞生物的遗传物质是双链,DNA,病毒的遗传物质可以是单链的或双链的,DNA,或,RNA,， 即：,ssDNA,，,dsDNA,，,ssRNA,或,dsRNA,。,三,、,DNA,和,RNA,的分子结构和复制,遗传物质的复制,-,双链,DNA,的复制,（半保留复制）,密码子（,coden,）：,由,3,个核苷酸顺序决定，负载遗传信息的基本单位,不对称转录：,只有,DNA,双链的一股才作为有意义链被转录，这种现象又称不对称转录。,起始密码子：,AUG,，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸,终止密码子：,UAA,、,UGA,、,UAG,遗传密码,指,DNA,链上各个核苷酸的特定排列顺序,DNA,与遗传密码,四、转座因子和毒力岛,（一）转座因子,近年来发现微生物的某些,DNA,片段作为一个独立单位可以在染色体上移动，此种移动甚至发生在不同种细菌之间。这种可移动的,DNA,片段称之为转座因子。细菌的转座因子有三种类型：插入序列、转座子以及某些特殊的噬菌体。,（二）毒力岛,毒力岛是,20,世纪,90,年代提出的一个新概念。毒力岛是指病原菌的某个或某些毒力基因群，分子结构与功能有别于细菌染色体，但位于细菌染色体之内，因此称之为,“,岛,”,。其生物学意义尚不清楚,推测其与细菌的毒力变异有关。,第一节常见的微生物变异现象,形态、结构变异,毒力变异,耐药性变异,菌落变异,生化特性变异,1.,形态结构变异,3-6%,食盐鼠疫杆菌,多形态性,(,衰残型,),。,琼脂培基,形态结构变异,青霉素、溶菌酶正常形态细菌,L,型变异,抗体或补体,(,部分或完全失去胞壁,),正常霍乱弧菌,霍乱弧菌,L,型,形态结构变异,特殊结构的变异,42-43,炭疽杆菌,失去形成芽胞能力,毒性降低,10-20,天,变形杆菌（,H,）,0.1%,石炭酸 （,O,）,迁徙生长 单个菌落,鞭毛变异,连续通过易感动物,和其他微生物共生或被温和噬菌体感染。,例如魏氏梭菌与八叠球菌共生时毒力变强，无毒的白喉棒状杆菌被温和,-,噬菌体感染后产生白喉毒素，成为有毒细菌。,增强毒力的方法,2.,毒力变异,毒力变异,棒状噬菌体,白喉棒状杆菌,获得白喉毒素,减弱毒力的方法,通过非易感动物,例如：马尔他强毒布氏杆菌连续通过鸡育成弱毒株；猪丹毒苗,GC42,系将强毒株通过豚鼠传,370,代后又通过鸡传,42,代育成弱毒。,在较高温度下培养。强毒炭疽,42.5,下培养,弱毒,在含有某些特殊化学物质的培养基中培养。著名的 卡介苗,BCG,在含有抗血清，噬菌体或抗生素的培养基中培养。,长期的人工培养。,在特殊气体条件下培养。,如无荚膜炭疽芽胞苗是半强毒株在含,50%,血清的培养基上，在,50% CO,2,的条件下选育的。,通过基因工程的方法。去除毒力基因可获得无毒力株。,3.,耐药性变异,细菌对某种抗菌药物有敏感变成耐药的变异称为耐药性变异。,金黄色葡萄球菌耐青霉素的菌株已从,1946,年的,14%,上升至目前的,80%,。,有些细菌还表现为同时耐受多种抗菌药物，即多重耐药性，甚至产生药物依赖性。,含链霉素培基痢疾杆菌,依链株,(,耐药菌株,),长期培养,4.,菌落变异,光滑型粗糙型变异,S,型（,smooth,）菌落：光滑，湿润，边缘整齐。,R,型（,rough,）菌落：菌落表面粗糙，枯干，边缘不整齐。,一般来说，,SR,毒力由强变弱，但炭疽杆菌，结核分支杆菌，,正常菌落为,R,型,S,型，毒力减弱,R,菌落,S,菌落,D,菌落的变异,当细菌接触某些化学物质时如,CuSO4, LiCl,形成细小菌落叫,D,菌落。（,dwarf clone,侏儒菌落）,5.,生化特性变异,乳糖操纵子,第二节 微生物变异的机制,一、突变（,mutation,）,指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。,染色体畸变,细胞学上可以看到染色体的变,基因突变,细胞学上看不到遗传物质的变化,突变体（,mutant,）,发生了突变的微生物细胞或菌株,野生型（,wild type,）,从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的,原始菌株,(,一,),突变的特点,不对应性,：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。,自发性,：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。,稀有性,：突变率低且稳定。,独立性,：各种突变独立发生，不会互相影响。,可诱发性,：诱变剂可提高突变率。,稳定性：,变异性状稳定可遗传。,可逆性,：从原始的野生型基因到变异株的突变,称为正向突变（,forward mutation,），从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（,back mutation,或,reverse mutation,）。,变量试验又称波动试验或彷徨试验。,1943,年，,S. E. Luria,和,M. Delbr,ck,根据统计学原理，设计了左方的实验。,1.,变量试验,fluctuation test,2.,涂布试验,原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。,(,二,),突变机制,诱变剂（,mutagen,）,：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂,.,种类：,诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。,诱发突变,1.,碱基置换（,substitution,）,定义,：对,DNA,来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（,microlesion,），一般也称点突变（,point mutation,）。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。,分类：,转换（,transition,），,即,DNA,链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；,颠换（,transversion,），,即一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换。,对某一具体诱变剂来说，即可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。,亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用,HNO,2,胞嘧啶（,C,） 尿嘧啶（,U,）,HNO,2,腺嘌呤（,A,） 次黄嘌呤（,H,）,HNO,2,鸟嘌呤（,G）,黄嘌呤（,X,）,这些反应及形成物均可在,DNA,复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。,碱基转换的分子机制,以亚硝酸为例,若干诱变剂的作用机制及诱变功能,诱变因素,在,DNA,上的初级效应,遗传效应,碱基类似物,掺入作用,AT=GC,双向转换,羟 胺,与胞嘧啶起反应,GCAT,的转换,亚硝酸,A,、,G,、,C,的氧化脱氨作用,交 联,AT=GC,双向转换,缺失,烷化剂,烷化碱基（主要是,G,）,烷化磷酸基团,丧失烷化的嘌呤,糖,-,磷酸骨架的断裂,AT=GC,双向转换,ATTA,的颠换,GCCG,的颠换,巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）,丫啶类,碱基之间相互作用 双链变形,码组移动（或）,紫外线,嘧啶的水合物,形成嘧啶的二聚体,交 联,GCAT,转换,码组移动（或）,电离辐射,碱基的羟基化核降解,DNA,降解,糖,-,磷酸骨架的断裂,丧失嘌呤,AT=GC,双向转换,码组移动（或）,巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）,加热,C,脱氨基,CGTA,转换,Mu,噬菌体,结合到一个基因中间,码组移动,2.,移码突变,frame-shift mutation,或,phase-shift mutation,，指诱变剂使,DNA,分子中增加（插入）或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。,由移码突变所产生的突变株，称为,移码突变株,（,frame-shift mutant,）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是,DNA,分子的微小损伤。,丫啶类染料，包括原黄素、丫啶黄、丫啶橙和,-,氨基丫啶等，以及一系列称为,ICR,类的化合物，都是移码突变的有效诱变剂。,能诱发移码突变的几种代表性化合物,引起移码突变的诱变剂：主要是,吖啶类染料，如吖啶黄、吖啶橙等等。,这类化合物都是平面型的三环分子，它们的结构与一个嘌呤,嘧啶对十分相似。,丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示,3.,染色体畸变（,chromosomal aberration,）,某些理化因子，如,X,射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起,DNA,的大损伤（,macrolesion,）,染色体畸变，它包括：,染色体结构上的变化：,缺失（,deletion,）,重复（,duplication,）,易位（,translocation,）,倒位（,inversion,）,染色体数目的变化,染色体结构上的变化,分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。,染色体内畸变,：只涉及一条染色体上的变化，,如发生染色体的部分,缺失,或,重复,时，其结果可造成基因的减少或增加；,如发生,倒位,或,易位,时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。,倒位,-,是指断裂下来的一段染色体旋转,180,后，重新插入到原来染色体的原位置上，从而使其基因顺序与其它的基因顺序相反；,易位,-,是指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。,染色体间畸变,：指非同源染色体间的,易位,。,自发突变机制,自发突变,是指在没有人工参与下生物体自然发生的突变。,几种自发突变的可能机制,微生物自身有害代谢产物的诱变效应,过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物。它对,Neurospora,（脉孢菌）有诱变作用，这种作用可因同时加入过氧化氢酶而降低，如果在加入该酶的同时又加入酶抑制剂,KCN,，则又可提高突变率。这就说明，过氧化氢很可能是,“,自发突变,”,中一种内源性诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能也是同样的原因。,环出效应,即环状突出效应。有人提出，在,DNA,的复制过程中，如果其中某一单链上偶然产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失，从而造成自发突变。,二、基因重组,定义：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（,gene recombination,）或遗传重组。,作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。,生长快、产量低,生长慢、产量高,基因重组,生长快、产量高,细菌的基因重组,基因重组的方式,转化,转导,接合,原生质体融合,定义,：,受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离,DNA,片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受体菌称为,转化子（,transformant,）。,有关名词：,受体菌：,recipient/receptor,，转化基因的接受者,供体菌,：,donor,，转化基因的提供者,转化因子：,来自供体菌的,DNA,片段,转化子：,transformant,，将转化基因重组进入自身染色体组的重组子,(,一,),、转化（,transformation,）,1,、转化及其发现,转化,受体细胞要处于感受态,.,感受态,：,competence,，受体细胞能从环境吸取外源,DNA,片段并实现其转化的一种生理状态,供体,DNA,片段（,转化因子,）,大小适宜，分子量一般为1, 10,7,D,左右,菌株间的亲缘关系密切,2,、转化发生的条件,3,、转化的类型,根据感受态建立的方式，可以分为：,自然遗传转化,natural genetic transformation,人工转化,artificial transformation,人工转化,人工转化,是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取,DNA,的能力，或人工地将,DNA,导入细胞内。,方法：,CaCl,2,处理细胞，使其成为能摄取外源,DNA,的感受态状态,.,电穿孔法,electroporation,：用高压脉冲电流击破细胞膜，或击成小孔，使各种大分子（包括,DNA,）能通过这些小孔进入细胞。,可转化的性状,荚膜多糖的合成,专一性酶的合成,专一性蛋白质的合成,抗药性,混合培养,(,二,),、转导（,transduction,）,J.Lederberg,等（,1952,）在,Salmonella typhimurium,中发现的。,1.,转导及其发现,定义：,以温和,噬菌体为媒介，将供体细胞的,DNA,片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，称转导子。,转导,溶原性转换,因前噬菌体基因插入寄主的基因组而使后者获得一些新性状的现象,.,2.,转导的种类,完全普遍转导,普遍转导,流产普遍转导,转导,低频转导,局限转导,高频转导,普遍性转导,概念：,受体菌经转导获得的供体,DNA,片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为,流产转导,。,现象：,发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源,DNA,分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物,酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释,.,流产转导,局限性转导,gal,bio,gal,bio,gal,bio,gal,bio,bio,gal,普遍性转导与局限性转导的区别,区别要点,普遍性转导,局限性转导,基因转导发生的时期,裂解期,溶原期,转导的遗传物质,供体菌染色体,DNA,任何部位或质粒,噬菌体,DNA,及供体菌,DNA,的特定部位,转导的后果,完全转导或流产转导,受体菌获得供体菌,DNA,特定部位的遗传特性,转导频率,受体菌的,10,-7,转导频率较普遍转导增加,1000,倍,(10,-4,),(,三,),、,接合,供体与受体细胞直接接触，借性菌毛传递,DNA,，在受体细胞中发生交换、整合，使之获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就称接合子。,(,四,),、原生质体融合,protoplast fusion,概念：,通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（,fusant,）的过程，称为原生质体融合。,适用范围：,各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各种原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。,意义：,70,年代后发展的一种育种新技术，继转化、转导和接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。原生质体融合不仅能在不同菌株或种间进行，还能做到属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合。,发展点：,有关原生质体融合的遗传机制，尚未研究清楚，目前还在探索中。,原生质体融合的优点：,可以提高重组率,双亲可以少带标记或不带标记,可进行多亲本融合,有利于不同种间、属间微生物的杂交,通过原生质体融合提高产量,原生质体融合的主要步骤,选择亲株 制备原生质体原生质体融合 原生质体 再生 筛选优良性状的融合重组子,三、微生物遗传变异的实际意义,诱变育种,在疾病的诊断、治疗与预防中的应用,在测定致癌物质中的应用,在流行病学中的应用,在基因工程中的应用,诱变育种,：,是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（,DNA,）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,诱变育种具有极其重要的实践意义,。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。,1.,诱变育种,诱变育种的基本过程,选择合适的出发菌株,制备待处理的菌悬液,诱变处理,筛选,保藏和扩大试验,1.,出发菌株的选择,出发菌株,用来育种处理的起始菌株,出发菌株应具备：,对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力； ,出发菌株的来源；,自然界直接分离到的野生型菌株： 历经生产考验的菌株： 已经历多次育种处理的菌株：,2.,制备细胞悬液,要求：,菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长； 细胞分散且为单细胞，以避免,表型迟延现象（,phenotypic lag,）,;,方法：,玻璃珠打散,10-15min; ,加,.3%,吐温,80,（表面活性剂） 用无菌脱脂棉过滤。,制备：,物理诱变剂,生理盐水（,0.85%NaCl),化学诱变剂,缓冲液,浓度：,细菌、放线菌,10,8,个,/ml,霉菌、酵母菌,10,6,个,/ml,表型迟延现象,:,指某一突变在,DNA,复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。,3.,诱变处理,诱变剂的作用：,提高突变的频率,扩大产量变异的幅度,使产量变异朝着正突变或负突变移动,剂量的表示法：,不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。,致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。,最适剂量的选择：,产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率的,70,80%,）,诱变处理方式：,单一因子处理：,复合因子处理：,先后使用,同时使用,单一因子重复使用,两种以上因素,2.,在疾病的诊断、治疗与预防中的应用,形态、结构、染色性、生化特性、抗原性及毒力等方面的变异，使得诊断复杂化,耐药菌株日益增多，因此以药敏实验为指导,减毒菌株和无毒株可制备成疫苗,3.,在测定致癌物质中的应用,凡能诱导细菌发生突变的物质都有可能是致癌物质。,4.,在流行病学中的应用,分子生物学分析方法已被用于流行病学调查,质粒指纹图（,PEP,）,对噬菌体的敏感性，对细菌素的敏感性,5.,在基因工程中的应用,基因工程是根据遗传变异中细菌可因基因转移和重组而获得新性状的原理设计的,切取目的基因,连接到载体上,转移到工程菌内，大量表达目的基因产物,目前已大量生产胰岛素、干扰素、多种生长激素、,rIL-2,等细胞因子和乙肝疫苗等生物制品,基因工程,1.,基因工程总体策略,2.,目标基因的克隆与鉴定,3.,宿主和载体,4.,重组蛋白的生产,基因工程总体策略,基因工程指用人为的方法将所需要的某一供体生物的,DNA,提取出来，在适当的条件下用适当的酶切割后，把它与载体,DNA,分子连接起来形成具有自我复制能力的,DNA,分子,复制子，并将它转移到宿主细胞中进行扩增和表达。,重组蛋白的生产品种、菌株改良遗传基因分析,蓝,-,白选择,活性筛选,1.,衰退（,degeneration,）,：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。,衰退的原因：,基因突变，分离现象。,常见的衰退现象：,菌落和细胞形态的改变；,生长速度缓慢，产孢子越来越少；,抵抗力、抗不良环境能力减弱等。,代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；,四、菌种的衰退、复壮及保藏,（一 ）菌种的衰退与复壮的概念,2,、 菌种的复壮,（,rejuvenation,）,：使衰退的菌种恢复原来优良性状。,狭义的复壮,是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；,广义的复壮,是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种,.,菌种的复壮措施：,纯种分离：,（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等,）。 通过寄主体内生长进行复壮（,如,Bacillus thuringiensis,的复壮） ；,淘汰已衰退的个体,（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。,采用有效的菌种保藏方法。,3,、防止菌种衰退的方法：,控制传代次数（一般在,DNA,的复制过程中，碱基的错配率是,5x10,-4,，自发突变的频率为,10,-8,-10,-9,，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）； 选择合适的培养条件； 采用有效的菌种保藏方法。,1.,目的：,存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种,2.,原理：,选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）,（二）、菌种保藏,菌 连续在培养基上（内）移种,种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种,保 固体斜面,藏 湿法 半固体琼脂柱,方 休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）,法 干法 藏在玻璃管内,吸附在合适的载体上,3.,菌种保藏的方法,方法：,低温保藏法,方法：菌种管置,4,冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。,石蜡油低温保藏,法：,橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。,干燥保藏法,将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。,真空冷冻干燥法,加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。,适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。,液氮超低温保藏法,将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（,-196,）。,适用于各种微生物的较理想的保藏方法。,几种常用菌种保藏方法的比较,方法名称,主要措施,适宜菌种,保藏期,评价,冰箱保藏法,（斜面）,冰箱保藏法,（半固体,）,石蜡油封藏法*,沙土保藏法,冷冻干燥法,低温,低温,低温、缺氧,干燥、无营养,干燥、无氧、低温、有保护剂,各大类,细菌、酵母菌,各大类*,产孢子微生物,各大类,36,月,612,月,12,年,110,年,515,年,以上,简便,简便,简便,简便,有效,简便,有效,菌种保藏机构的任务,：,广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。,菌种保藏机构,中国微生物菌种保藏委员会,(CCCCM),美国的典型菌种保藏中心,(ATCC),英国国家典型菌种保藏所（,NCTC,）,法国里昂巴斯德研究所（,IPL,）,国内外菌种保藏机构,微生物分类学,(Taxonomy),是一门按微生物类群的亲缘关系把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群（,Taxon,）的科学,分类学的任务,分类（,Classification,）：是指根据相似性或亲缘关系，将一个有机体放在一个单元中。,命名（,Nomenclature,）：是按照国际命名法规给予有机体一个科学的名称,鉴定（,Identification,）：是指确定一个新分离物是否归属于某个已命名的分类单元的过程。,第三节细菌的分类与命名,命名的任务,是为一个新发现的微生物确定一个新学名，亦即当你详细观察和描述一个未知菌种后，经过认真查找现有的权威性分类鉴定手册，发现这是一个以往还未记载过的新种，这时，就得按微生物的国际命名法规给以一个新的学名。,一、细菌在生物中分类地位,目前公认“四界分类系统”,动物界,植物界,原核生物：细菌、放线菌、螺旋体、,生物 原生生物界 霉形体、立克次氏体、衣原体,真核生物：真菌、藻类、原虫,病毒界：病毒,二 细菌的分类层次,界（,Kingdom,）,门（,Phylum or Division,）,纲（,Class,）,目（,Order,）,科（,Family,）,属（,Genus,）,种（,Species,）,种是最基本的分类单位。,但分类单元之间科加入亚门、亚纲、亚目、亚科等次要分类单位。种以下又可分为亚种、变种、型、菌株等,1.,种和属的概念,种,(species),是细菌分类的基本单位。,生物学性状基本相同的细菌群体构成一个,菌种,；,同一菌种的各个细菌,虽性状基本相同,但在某些方面仍有一定差异,差异较明显的称,亚种,( subspecies,subsp.),或,变种,(,variety, var.),差异小的则为,型,(type),。,性状相近关系密切的若干菌种组成一个,菌属,(genus),。,2.,微生物亚种以下的变型分类,亚种以下,生物变型,表示特殊的生化或生理特征,血清变型,表示抗原结构不同,致病变型,表示某些寄主的专一致病性,噬菌变型,表示对噬菌体的特异性反应,形态变型,表示特殊的形态特征,3.,菌株,对不同来源的同一菌种的细菌称为该菌的不同,菌株,(strain),。,具有某种细菌典型特征的菌株称为该菌的,标准菌株,(standard strain),或,模式菌株,(type strain),Corynebacterium pekinenese,nov.sp.AS1.299,（北京棒杆菌,AS 1.299,，新种）。 在新种发表前，其模式菌株的培养物就应存放在一个永久性的菌种保藏机构中，并允许人们能从中取得。,三、细菌的命名法,拉丁文双命名法,属名,+,种名,(,中文的命名次序适与拉丁文相反,),Staphylococcus aureus,金黄色葡萄球菌；,Escherichia coli,大肠埃希菌；,Neisseria meningitidis,脑膜炎奈瑟菌等,常见菌通用的俗名,tubercle bacillus,结核杆菌,; typhoid bacillus,伤寒杆菌,;,泛指某一属细菌,不特指其中某个菌种,则可在属名后加,sp.,(,单数,),或,spp.,(,复数,),如,Salmonella sp,.,表示为沙门菌属中的细菌,1.,俗名与学名 每一种微生物都有一个自己的名字，名字有俗名（,common name,）和学名（,scientific name,）两种。俗名指普通的、通俗的、地区性的名字，具有简明和大众化的优点，但往往涵义不够确切，易于重复，使用范围局限。,例如“结核杆菌”（,tubercle bacillus,俗名）用于表示,Mycobacterium tuberculosis,（结核分枝杆菌，学名）；以此类推有：“绿脓杆菌”用于表示,Pseudomonas aeruginosa,（铜绿假单胞菌），“白念菌”表示,Candida albicans,（白色假丝酵母），“金葡菌”表示,Staphylococcus aureus,（金黄色葡萄球菌）,学名则指一个菌种的科学名称，它是按照,国际细菌命名法规,命名的、国际学术界公认并通用的正式名字。,有关学名的若干规定与常识： 属（或亚属）名：,是一个表示该种微生物主要特征的名词或用作名词的形容词，单数，其第一个字母应大写。其词源可来自拉丁词、希腊词或其他拉丁化的外来词，也可以组合方式形成。,如,Bacilllus,（芽抱杆菌属）可写成“,B,”，,Streptomyces,（链霉菌属）可缩写成“,S,”，,Pseudomonas,（假单胞菌属）可缩写成“,P,”，,Aspergillus,（曲霉属）可写成“,A”,等。如果有可能产生混淆，也可写两至三个字母，例如“,Bac,.”,（,Bacillus,），“,Ps,”（,Pseudomonas,）和“,Pen,”（,Penicillium,青霉属）等。,种的加词：代表一个种的次要特征，同样由拉丁词、希腊词或拉丁化的外来词所组成。字首一律小写（即使它是由某一人名衍化而来，首字母也不应大写）。它可以是一个形容词或名词。在出版物中，种的加词与属名一起均应排成斜体。,在实际工作中，有时手头筛选到一个有用的菌种，其属名很易确定，但种名还未确定。在这种情况下，当发表论文或进行学术交流时，其种的加词暂时可以用“,SP,”（正体字）代替。例如“,Bacillus,sp.”,即表示一个尚未定出种名的芽孢杆菌，可译为“一种芽孢杆菌”。同样，“,Bacillus,spp”,（,Spp,为,species,复数的简写） 表示一批尚未定种名的芽孢杆菌， 故可译为“若干芽孢杆菌”。,学名的发音：按规定，学名均应按拉丁字母发音规则发音。事实上，英、美等国学者经常按自己的文种来对学名发音，影响颇大，且已习惯成自然。,变种（,variety,，,var,） 变种是亚种,(subsp.),的同义词，因易引起混乱，故,国际细菌命名法规,（,1975,）已规定它在命名法中没有地位，且不主张使用。,型 在亚种以下的“型”（,form,）曾用于表示细菌菌株，但目前已废除。目前尚在使用的是以“型”作后缀使用，例如生物变异型（,biovar,）、化学型（,chemoform,）等（见下表 ）。,在上述各菌株符号中，有的是随意的，有的是研究机构的名称如“,BF”,为“北纺”（北京纺织工业局科学研究所）的缩写，有的则是菌种保藏机构的缩写，如,AS,即代表,Academia Sinica,（中国科学院），,ATCC,即代表,American Type Culture Collection,（美国模式菌种保藏中心）等等。,四 微生物的分类技术水平,微生物分类中使用的技术水平,细胞形态水平,细胞组分水平,蛋白质水平,基因组水平,五 微生物的分类方法,1.,经典分类鉴定法,形态特征,：,个体 群体,生理生化特征：营养要求（碳源，氮源，生 长因子）；代谢产物（种类，产量，显色反应等）；酶（产酶种类，反应特性等）,生态学特征：生长温度，对氧需要，酸碱要求，宿主种类等,血清学反应,噬菌体的敏感性,其他,微生物的分类方法,2.,数值分类法又称阿得逊氏法,（,Adansonian classification),以两两菌株的形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性及生态特征为依据,由计算机计算两者之间的总近似值，列出相似值矩阵，将相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱,微生物的数值法分类,微生物的分类方法,3.,化学分类法,（,Chemotaxonomy,）,根据微生物细胞的特征性化学组成分对微生物进行的分类方法,微生物分类方法,4.,遗传学分类方法,DNA,中,G+C,含量百分比分析,细菌含量变化范围在,25%75%,，放线菌在,37% 51%,。,2,种之间差异超过,10%,，肯定不是同一个种,DNA-DNA,杂交,测定杂合的百分数，如同一种，应为,100%,DNA-rRNA,杂交和,16SrRNA,寡核苷酸的序列分析,分析后作出相似性图，关系近的集中到一起，关系远的在图上占据不同的位置,六 细 菌 分 类 系 统,最有代表性和最有影响的细菌分类系统,伯杰氏细菌鉴定手册,（,Bergey,s Manual of Determinative Bacteriology),1923,年, 1925,年, 1930,年, 1934,年, 1939,年, 1948,年, 1957,年, 1974,年分别出版了第一至第八版，,1994,年出了第九版,以形态、生理生化、,G + C mol%,、生态分布等特征为主,第九版,伯杰氏系统细菌学手册,简介,1,、和以前的版本相比，在新版中，增加了许多新科、新属和新种。为了使发表的材料能及时反映新的进展，并考虑读者使用的方便，将手册分成,4,卷，各卷的主要内容如下；,第,1,卷：一般医学和工业方面重要的革兰氏阴性细菌。,第,2,卷：放线菌以外的革兰氏阳性细菌。,第,3,卷：古细菌、蓝细菌及其他革兰氏阴性细菌。,第,4,卷,:,放线菌。第,1,卷及第,2,卷相继于,1984,年和,1886,年出版，其余,2,卷于,1989,年出版。,伯杰氏手册自从,1923,年出版第,1,版，直至,1974,年第,8,版，均使用,伯杰氏鉴定细菌学手册,(Bergeys Manual of Determinative Bacteriology),名称。第,9,版更名为,伯杰氏系统细菌学手册,。,第九版,伯杰氏系统细菌学手册,简介,2,、新的版本，在,“,细菌分类,”,一章中，专题论述了近代发展起来的一些新的分类方法，如数值分类、核酸在细菌分类中的应用、遗传学方法、血清学和化学分类等。,3,、手册新版的一个突出变化是鉴定方法的革新。新版在表型特征基础上，以,DNA,资料对属、种的分类地位给予决定性的判断。将,DNA,中,G+C mol,含量的测定、,DNA,杂交、,RNA,寡核苷酸的顺序分析、细胞化学分析、数值分类等方法应用到细菌的分类学上，改变了过去细菌分类过多的依赖人为因素的局面。,伯杰氏系统细菌学手册,（,Bergey,s Manual of Systematic Bacteriology) second edition 2001,以生理生化、,G + C mol%,、系统发育地位等为主,体现了现代分子生物学的研究成果,The End,