实验-两对半的检测ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,ELISA检测,“,乙肝二对半,”,(Enzyme linked immunosorbent Assay,ELISA,),ELISA检测“乙肝二对半”,1,酶免疫技术,分类,酶免疫组化,酶免疫测定,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,均相酶免疫测定,非均相酶免疫测定,酶免疫技术分类 酶免疫组化 酶免疫测定 固相酶免疫测定 液相,2,ELISA的概念,酶联免疫吸附试验,（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）,酶联,：抗原或抗体的酶标记。,免疫,：以抗原抗体特异性反应为基础。,吸附,：抗原或抗体包被于固相载体表面。,在固相载体表面实现抗原抗体的反应，通过酶标记的手段，酶催化底,物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本中的,抗原或抗体的量直接相关。,ELISA的概念酶联免疫吸附试验（enzyme-linke,3,ELISA技术特点,具有良好的,灵敏度,和,特异性,，能满足临床需要，应用广泛。,操作,简单,、无需昂贵的仪器投入，价格,便宜,。,对环境几乎,没有污染,。,ELISA技术特点具有良好的灵敏度和特异性，能满足临床需要，,4,ELISA技术的应用,检测,抗原,的方法：,双抗体夹心法,竞争法,检测,抗体,的方法,：,双抗原夹心法,间接法,竞争法,捕获法,ELISA技术的应用检测抗原的方法：检测抗体的方法：,5,实验目的,掌握ELISA法检测,“,乙肝二对半,”,的,原理、操作,步骤,及注意事项。,掌握检测,“乙肝,二对半,”,的临床意义。,实验目的掌握ELISA法检测“乙肝二对半”的原理、操作步骤,6,什么是“乙肝二对半”？,“,乙肝两对半,”,是指：,表面抗原（HBsAg）、表面抗体（HBsAb）、e抗原（HBeAg）、e抗体（HBeAb）、核心抗体（HBcAb）,HBsAg本身不具有传染性，只具有抗原性,保护性抗体：HBsAb,传染性指标：HBeAg，HBcAg,HBeAb，HBcAb不是保护性抗体，而是反映曾被HBV感染的重要指标。,什么是“乙肝二对半”？“乙肝两对半”是指：表面抗原（HBsA,7,为什么不检测核心抗原（HBcAg）,HBcAg主要位于病毒颗粒中，只有少数游离。,机体免疫系统对HBcAg很敏感，易产生高滴度的HBcAb,与HBcAg 形成免疫复合物。,血清中，HBcAg可丢失部分氨基酸。,为什么不检测核心抗原（HBcAg）HBcAg主要位于病毒颗粒,8,“乙肝二对半”的检测原理,HBsAg,：,双抗体夹心法,HBsAb,：,双抗原夹心法,HBeAg,：,双抗体夹心法,HBeAb,：,中和竞争法,（血清中的e抗体与固相e抗体竞争结合e抗原）,HBcAb,：,竞争抑制法,“乙肝二对半”的检测原理HBsAg：双抗体夹心法,9,双抗原（体）夹心法测抗体（,原,）,包被抗原,*,酶标抗原,待测抗体,包被抗体,*,酶标抗体,待测抗原,Anti-HIV,Anti-HBs,双抗体夹心法,双抗原夹心法,HBsAg,HCV core Ag,HBeAg,HBV preS1,PreS2,双抗原（体）夹心法测抗体（原）包被抗原*酶标抗原待测抗体包被,10,洗涤,洗涤,双抗体夹心法测抗原,+,-,Y,Y,Y,E,Y,E,Y,E,Y,Y,E,Y,E,Y,E,Y,Y,Y,Y,E,Y,E,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原+-YYYEYEYEYYEYEYE,11,竞争抑制法测抗体,包被抗原,待测抗体,*,酶标抗体,Anti-HBc,Anti-HB,e,竞争抑制法测抗体 包被抗原待测抗体*酶标抗体 Anti,12,中和竞争法测抗体,包被抗体,中和,抗原,待测抗体,*,酶标抗体,Anti-HB,e,中和竞争法测抗体包被抗体中和抗原待测抗体*酶标抗体Anti-,13,试剂盒组成,包被反应,板,：固相的抗原或抗体,酶结合物：酶标记的抗原或抗体,显色剂：分A、B二瓶,终止液,对照：阳性对照，阴性对照,浓缩,洗涤液,中和试剂（,只有检测HBeAb的试剂盒才有,）,试剂盒组成包被反应板：固相的抗原或抗体,14,实验准备,配制洗涤液：用蒸馏水按1：20稀释浓缩洗涤液。,为节省试验时间，除检测,核心抗体（HBcAb,）组外，其余组可在加样后的温育时间中才配制洗涤液。,实验准备配制洗涤液：用蒸馏水按1：20稀释浓缩洗涤液。,15,实验操作,1,、,加样：第一、二孔为阴、阳对照孔，分别加入阴、阳对照50ul。其余各孔为样品孔，各加入待测标本50ul（,检测HBcAb 时，待测标本需用稀释后的洗涤液做1：30稀释,）。,2、加中和试剂（,只有检测HBeAb时才需要,）：每孔50ul,3、加酶结合物：每孔50ul,4、温育：封板充分混匀后置37C水浴30分钟,5、洗涤：弃去反应条孔内液体，用洗涤液注満每孔，放置或振荡1分钟，弃去拍干反复5次（,注意：最后一次一定要拍干,）,6、显色：每孔先加显色剂A 50ul，再加显色剂B 50ul，混匀后置37C水浴10分钟,7、中止显色：每孔加入中止液50ul,8、判断结果：,实验操作1、加样：第一、二孔为阴、阳对照孔，分别加入阴、阳对,16,目测法,：,HBsAg,，,HBsAb,，,HBeAg,目测法：HBsAg，HBsAb，HBeAg,17,HBeAb,，,HBcAb,HBeAb，HBcAb,18,比色法：波长450nm读取各孔OD值,HBsAg，HBsAb，HBeAg,样品OD值/阴性对照OD值2.1,HBeAb，HBcAb,阴性对照OD值/样品OD值2.1,（,建议,双波长,比色,（450/630nm）；,临界值的确定请参考实验指导，不同的试剂盒和检测原理，临界值的设定均不同,）,阳性,阳性,阳性阳性,19,ELISA的注意事项,标本,：内源性（RF、补体、嗜异性抗体等）,外源性因素（溶血、细菌污染、保存不当、凝集不全、防腐剂NaN,3,等）（,P229,）,试剂,：试剂质量、批号、是否失效（冰箱温度）、平衡（37度,C,30分钟）、摇匀,加样,：,加样准确、,不可太快，避免加在上部和产生气泡。,温育,：温度（定期观察与登记）、时间、湿度、封片（不可重复用）,洗板,：洗涤液用蒸馏水或去离子水现配、防止洗板机堵塞、洗完要拍板。,显色,：加试剂时不可重复加和漏加，或加在两孔之间，不要产生气泡，及时终止。,比色,：建议用双波长（可排除标本浓度、干扰色、电路干扰、板底部划痕的影响）。,结果判定,：反应终止后10分钟内,质量控制：,内对照、室内质控、室间质评等,（全程质控意识）,表面抗原阳性结果,、,灰区标本,、,矛盾结果,或少见模式,均须复查,生物安全：,试剂盒应视为有,传染性物质,，请按传染病实验室检查规程处理,。,ELISA的注意事项标本：内源性（RF、补体、嗜异性抗体等）,20,常见的检测模式,（临床意义2）,常见的检测模式（临床意义2）,21,思考题,sAg检测时，有哪些因素可能导致阴性对照孔也出现颜色？,为什么建议用双波长比色。,思考题sAg检测时，有哪些因素可能导致阴性对照孔也出现,22,