凝胶柱层析分析蛋白质分子量大小

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,分子生物学,2008,实验,一.试验目的,把握凝胶层系的原理、测定蛋白质分子量大小的方法,生疏并把握分子试验相关仪器的应用及操作,二.试验原理,层析技术：是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的外形和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、安排系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在两相中，是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术,全部的层析系统都由两个相组成：,固定相：是固体物质或者是固定于固体物质上的成分可以为固体、液体。,流淌相：即可以流淌的物质，如水和各种溶媒可以为液体或气体,二.试验原理,名称,分离原理,吸附层析法,固定相是固体吸附剂，组份在吸附剂表面吸附力不同,疏水力或静电引力,分配层析法,各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同，溶解度,离子交换层析法,固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同，离子间结合力,凝胶层析法,固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同，排阻效应,亲和层析法,固定相只能与一种待分离组份专一结合，亲和力,按原理，层析分类,二.试验原理 凝胶层析,凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析，是利用生物大分子相对的分子质量差异进展层析分别的方法。凝胶颗粒内部呈网状构造，筛孔直径全都。待分别的物质中，分子量大的分子分子直径大，无法进入凝胶颗粒网状构造的小孔穴内，它会从凝胶颗粒的间隙里通过，因此流出速度快；分子量小的分子会进入凝胶颗粒网状构造的小孔穴中穿行，因此流出速度慢,二.试验原理 凝胶层析,样品中各组分的流出挨次，可用安排系统Ka来量度,Ka=(Ve-Vo)/Vi,Ve：为洗脱体积，表示某一组分从层析柱洗出到最顶峰消失时，所需的洗脱液体积,Vo：外体积，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积可以用凝胶干重与湿重之差计算而得到,Vi：内体积，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积用分子量很大的物质实际测量而计算得到,二.试验原理 凝胶层析,当某组分的Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出,假设某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时，说明该组分可自由地集中进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最终流出,Ka在0-1之间的组分，洗脱时Ka值小的先流出，Ka值大的后流出。在限定的条件下，Vi和Vo都是恒定值,在一般状况下，凝胶对组分没有吸附作用。当洗脱液的体积等于Vo+Vi时，全部组分都应当被洗脱出来，即Ka的最大值为1。然而在某种状况下Ka值会大于1。这种反常现象说 明这一层析过程不是单纯的凝胶层析，其中可能还夹杂有吸附或离子交换等过程,蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关,Ve为洗脱体积,LogM=k,1,-k,2,Ve,先测得几种标准蛋白质的,Ve，并以其分子量对数对,Ve作图得始终线，再测出,待测样品的Ve，查标准曲,线即可确定分子量。,LogM,A,B,C,LogM,测,V,测,柱层析装置,(,恒流泵 层析柱 收集器 主机 记录仪等,5,件套,),三,.,仪器和试剂,四,.,操作步骤,装柱：凝胶溶胀后，湿法装柱，以柱床均匀、无气泡外表平坦为佳,系统平衡：连接各装置，用缓冲液洗涤柱子，并翻开检测器，使检测器稳定,上样：分别加标准分子量蛋白质和1ml 血清。,洗脱、记录,结果计算及分析,留意事项,要通过试验合理调整流速、检测器和记录仪的灵敏度，和记录仪的走纸速度，才能获得良好的洗脱曲线,假设峰有重叠，宜加长柱子，降低流速,假设峰间距离过大，峰过宽，宜缩短柱子，加快流速，降低走纸速度,峰过高，可削减加样量，或降低检测器和记录仪的灵敏度,峰过低则需加大灵敏度，或加大加样量。,问 题 思 考？,制作标准曲线，测出蛋白质分子量大小,测量觉察，血液中有几种蛋白？,