医学流式细胞术及其应用生化经典

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流,式细胞术及其应用,第 一 部 分,流式细胞术的一般介绍,概念,流式细胞术,（,Flow Cytometry,，,FCM,）,利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单,细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特,定群体加以分选的现代细胞分析技术。,流式细胞仪,（,Flow Cytometer),集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算,机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的,一种新型高科技仪器。,流式细胞仪,特点,单细胞悬液或生物颗粒,分析速度高,多参数,精度高,当代最先进的细胞定量分析技术,FACSCalibur,特点：,光路调节系统固定,自动化程度高,操作简便,使用寿命长,配备,1-2,根激光,细胞分选速度慢，,主要用于细胞分析,临床型（台式机）,BD LSR,FACS Vantage DiVa,科研型（大型机）,特点：,多数字化,适用用各类细胞分选,4,路分选,FACSAria,科研型,特点：,分辨率高,选配多种波长和类型激光器,可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（,4,路和,24,孔板）,适用于高速分选和多色分析,流式细胞仪检测范围,细胞大小,细胞粒度,细胞表面面积,核浆比例,DNA,含量与细胞周期,RNA,含量,蛋白质含量,细胞结构,特异性抗原,（细胞表面,/,胞浆,/,核）,细胞内细胞因子,细胞活性,酶活性,激素结合位点,细胞受体,细胞功能,临床研究,淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、,HLA-B27,分析、,PNH,诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、,AIDS,诊断与治疗和疗效评价、,flow-FISH,法测定端粒长度,基础研究,淋巴细胞功能、树突状细胞（,DC,）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（,MDR,）、肿瘤相关基因表达研究、,RNA,测定、,DNA,测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、,血管内皮细胞研究,流式细胞仪的工作原理,光学系统,激光光源,光收集系统,液流系统,流动室,液流驱动系统,电子系统,光电转换,数据处理系统,细胞分选系统,激光光源,单波长、高强度、高稳定性,多采用氩离子激光器或氦氖激光器,一般选配,2-4,根激光，,488nm,、,633nm,和,355nm,、,407nmUV,激光,最多检测,13,个荧光参数,Longpass Shortpass Bandpass,460 500 540,460 500 540,460 500 540,SP 500,LP 500,BP500/50,光收集系统：滤光片,光收集系统：光电倍增管（,PMT,）,FACSCalibur,光路图,液流系统：流动室、液流驱动系统,液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱,细胞分选系统,Fluorescence Activated Cell Sorting,488,nm,laser,+,-,Charged Plates,Single cells sorted,into test tubes,FALS Sensor,Fluorescence detector,信号检测,-,散色光,FSC,（小角散射,),光它反应细胞的相对大小和截面积的大小,SSC(,90,度角散射光,),代表细胞的颗粒度和精细结构的变化,全血细胞流式,FSC-SSC,图,它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分,信号检测,-,荧光信号,自发荧光,特异荧光,特异荧光,能量级,激发,激发态,发射,激光,能量损失,数据显示类型,单参数直方图,（,Histogram,）,X,轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系,Y,轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率,二维等高图和密度图,Pseudo 3D Plot,3D Plot,二维点图,Dot Plot,便于数据统计,不同的细胞群可以用不同的颜色标记,主要表达方式,光谱交叉,Emission wavelength(nm),530 580 630 680 730 780,FITC,PE,PE-,TR,PE-CY5,4 colors-simultaneous collection,两色以上荧光分析存在 光谱交叉,荧光补偿,方法,所有补偿调为“,0”,调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”,依单阳群体调节荧光补偿,抗体使用原则,根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体,低表达抗原标记高,S/N,（信噪比）荧光素，如,PE,、,APC,使用双标以上抗体必做荧光补偿,样品,培养细胞,新鲜组织,石蜡包埋,单细胞,悬液,标记,荧光抗体,检测,表型测定,细胞分选,流式细胞术操作流程,统计学,分析,继续,培养,第 二 部 分,流式细胞术在不同领域的应用,细 胞 周 期 分 析,样品制备,1000,rpm 5,分钟,收集,2X10,6,个细胞,PBS,漂洗,两次,70%,酒精,4,度固定过夜,收集固定的细胞,PBS,漂洗,0.5 PBS,悬浮细胞,2.5l,10g/l,RNase A,37,度消化,1,小时,过,300,目细胞筛,50l 0.1mg/ml PI,（含,1%Triton),，,1000,rpm 5,分钟,离心,两次,混匀，室温,静止,5,分钟,上机,建立获取模式，获取数据,（,PI,单染分析细胞周期，同时看凋亡）,去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用,数据分析,圈门去除细胞碎片，分析细胞凋亡,圈门去除粘连体，分析细胞周期,细胞凋亡分析,Annexin V-PE/7-AAD,双染色法,双阴：活细胞,Annexin V-PE,单阳：早期凋亡细胞,双阳：晚期凋亡细胞,7-AADd,单阳：坏死细胞,人外周血淋巴细胞亚群检测,T,淋巴细胞,T,淋巴细胞检测,淋巴细胞,CD4,+,T,（,Th,),淋巴细胞检测,淋巴细胞,CD4+,CD8,+,Ts,淋巴细胞检测,淋巴细胞,CD8+,B,淋巴细胞检测,淋巴细胞,B,淋巴细胞,NK,细胞检测,淋巴细胞,NK,细胞,结束语,流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，我们的宗旨是将这项高新技术灵活运用于临床、科研等领域，报告最科学、最真实的客观数据，以服务于全社会。,