实验1-大肠杆菌的培养与分离ppt课件

单击此处编辑标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验1 大肠杆菌的培养与分离,第一部分,:,微生物的应用,实验1 大肠杆菌的培养与分离第一部分:微生物的应用,1,细菌的革兰氏染色,(P23),革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的,差别在于细胞壁的成分不同,。,大肠杆菌属于革兰氏,阴性,菌,异养兼性厌氧菌,细菌的革兰氏染色(P23)革兰氏染色法是一种用于细,2,细菌的外形与大小,大肠杆菌属于杆状菌,图,1-1,常见的三种细菌典型形态,A.,球菌,B.,杆菌,C.,弧菌,细菌的外形与大小大肠杆菌属于杆状菌图1-1 常见,3,二、培养基,培养基（培养液）是,由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养,液。,（1）按物理状态来分：,培养基可分为,固体培养基,和,液体培养基,。,（2）按功能来分，可分为,选择培养基,和,鉴别培养基,。,（3）按成分来分，可分为,天然培养基,和,合成培养基,。,1.,培养基的类型和用途,液体培养基：,扩大培养,固体培养基：,分离、纯化,二、培养基 培养基（培养液）是由人工方法配,4,2.,不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方,3.,不管哪种培养基，一般都含有,水,、,碳源,、和,氮源,、,无机盐,、,生长因子,等,营养物质，另外还需要满足微生物生长对,pH,、,氧气,、,渗透压,的要求,细菌喜荤，霉菌喜素,细菌中性偏碱，霉菌中性偏酸,2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 3.不管哪种培,5,单个或少数细菌在,固体培养基,上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的,子细胞群体,，叫做菌落,。,菌落是,鉴定菌种,的重要依据。,菌落,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见,6,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长,7,无菌技术,1.,无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有,防止杂菌污染,的方法。,成功地培养微生物的关键。,无菌技术1.无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生物的,8,（）,消毒定义：,三,.,消毒与灭菌的概念及两者的区别,（,2,）灭菌的定义：,3.,常用的消毒与灭菌的方法,是指,利用化学或物理方法，,杀灭,大部分,病原微生物的方法。,是指,利用化学或物理方法，,杀灭或清除环境中,一切,微生物（包括,芽胞,、,孢子,）的方法,（）消毒定义：三.消毒与灭菌的概念及两者的区别（2）灭菌,9,高压蒸汽灭菌,灼烧灭菌,干热灭菌,灭菌方法：,煮沸消毒法 巴氏消毒法,(,70-75,，保温,30,分钟,),化学药剂消毒法（酒精、氯气等）紫外线消毒法,消毒方法：,培养基、无菌水、,各种耐高温的玻璃金属器具,需要,保持干燥,耐高温的玻璃金属器皿,接种环等金属器具,高压蒸汽灭菌锅,1kg/cm,2,、,121,下维持,15min.,三、消毒和灭菌,彻底杀死,部分杀死,高压蒸汽灭菌灭菌方法：煮沸消毒法,10,1,、灼烧灭菌,1、灼烧灭菌,11,1.,无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.,请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。,（,1,）培养细菌用的培养基与培养皿,（,2,）玻棒、试管、烧瓶,（,3,）实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（,1,）、（,2,）需要灭菌；（,3,）需要消毒。,思考,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外,12,实验用具,LB,固体培养基,大肠杆菌菌液（,LB,液体培养基）,培养皿,接种环,酒精棉,酒精灯,镊子、火柴、记号笔,实验用具LB固体培养基,13,实验1-大肠杆菌的培养与分离ppt课件,14,二、大肠杆菌的培养和分离实验操作,（一）培养基的配制与灭菌,取,2,个,250ml,的三角瓶中分别装入,50mlLB,液体培养基和,50mlLB,固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌,15min,。,LB,液体培养基,细菌的扩大培养,LB,固体培养基,细菌的划线分离,封口膜：既通气又不使菌进入,二、大肠杆菌的培养和分离实验操作 （一）培养基的配制与灭,15,（二）倒平板,灭菌后的培养基在,无菌操作台,上，,酒精灯火焰,附近，倒入,4,个培养皿中，倒后立即置于,水平,位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面,（二）倒平板 灭菌后的培养基在无菌操作台上，酒精,16,倒平板技术,通过灼烧灭菌，防止瓶口的,微生物污染培养基。,60,倒平板技术通过灼烧灭菌，防止瓶口的60,17,注意事项：,1.,培养基灭菌后，需要冷却到,60,左右时，才能用来倒平板,2.,灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒,3.,操作时右手无名指和小指,夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在,酒精灯火焰旁,操作,.,4.,需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，,灼烧灭菌,5.,平板冷凝后，要将,平板倒置,可以防止皿盖上的水珠落入培养基，,造成污染,；若培养皿中已形成菌落，,很难再形成单菌落，达不到分离目的。,注意事项：,18,1.,培养基灭菌后，需要冷却到,60,左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：,可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,1.培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能,19,2.,平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,3.,在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又,可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,2.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？3.在倒平板的过程中，如,20,（三）大肠杆菌的扩大培养,将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到,灭菌后的液体培养基,中,使其在,37,摇床培养,12,小时。,注意事项,:,1.,火焰旁,从斜面上用接种环取菌,;,2.,取菌前,接种环要,用酒精灯,灼烧,灭菌,冷却后方能取菌,;,3.,取菌后封口膜和棉塞复原,.,（三）大肠杆菌的扩大培养 将斜面上培养的大,21,（,四,）大肠杆菌的分离,分离方法,:,划线分离法和涂布分离法,1,、划线分离法,无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的平板上连续划线,.,（四）大肠杆菌的分离分离方法:划线分离法和涂布分离法1、划线,22,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；,二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；不能使,23,（,四,）大肠杆菌的划线分离,注意事项,:,1.,接种环,只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置,连续划线多次,.,2.,划线,首尾不能相接,3.,划线后,培养皿,倒置培养,1224h,1,、划线分离法,（四）大肠杆菌的划线分离注意事项:1、划线分离法,24,实验1-大肠杆菌的培养与分离ppt课件,25,问题讨论,1.,为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了,避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；,每次划线前灼烧接种环是为了,杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种,，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到,单,菌落。,划线结束后灼烧接种环，能及时,杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染,环境和感染操作者,。,问题讨论 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧,26,2.,在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.,在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划,27,分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是,消除污染杂菌的通用方法,也是用于,筛选高表达量菌株,的最简便方法之一,分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是消除污染杂菌的通用方法,28,2,、涂布分离法,:,是指将培养的,菌液稀释,一定的倍数,然后取一定量稀释液加在,固体培养基,上,用,玻璃刮刀涂布,在培养基平面上,.,2、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量,29,划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？,划线分离：,方法简单，但单菌落较难分开。,涂布分离：,单菌落更易分开，但操作复杂。,划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：方法简单，但单菌,30,（,五,）大肠杆菌分离后保存,1,、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于,4,冰箱保存。,2,、长期保存：甘油冷冻管藏法,（五）大肠杆菌分离后保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，,31,1.,在培养后如何判断是否有杂菌污染,?,（,1,）,菌落的形态,看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。,是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。,（,2,）,显微镜观察其形态、大小,、看是否有菌丝、孢子、,芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。,（,3,）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和,进一步的形态观察，如用,革兰氏染色法,等。,1.在培养后如何判断是否有杂菌污染?（1）菌落的形态看，是否,32,2.,实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理,?,所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；,使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃,2.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?所有接触过菌的器,33,3.,如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的大肠杆菌所污染,?,转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的,DNA,序列，所以,可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。,3.如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的大肠杆菌,34,（一）培养基的制作是否合格,将未接种（空白）的培养基放在恒温箱中保温,1,2 d,后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,（二）接种操作是否符合无菌要求,如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。,（一）培养基的制作是否合格,35,例,1,下面对发酵工程中灭菌的理解,不正确,的是,A.,防止杂菌污染,B.,消灭杂菌,C.,培养基和发酵设备都必须灭菌,D.,灭菌必须在接种前,答案：,B,解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。,A,说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；,B,是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。,C,是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,例1下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是