蛋白质表达和抗体制备(共28张PPT)

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,蛋白质表达和抗体制备,第一页，共28页。,常用蛋白表达系统,(host),原核：大肠杆菌,。,真核：酵母、昆虫、哺乳动物、植物。,第二页，共28页。,大肠杆菌表达系统,大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。,优越性：,对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解；,商品化的载体和菌株种类非常齐全；,表达效率高；,易培养，成本低。,缺点：,因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体；,蛋白质不能糖基化；,其内毒素很难除去。,第三页，共28页。,酵母表达系统,优越性：,蛋白可糖基化，有相对正确的天然结构，可很好的生产分泌型蛋白；,表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，实现高效率表达；,表达载体都为的穿梭载体，可在获得克隆后采用细胞大量,扩增。,易培养，成本低,可高密度发酵。,缺点：,糖基化与哺乳动物有所差别；,培养上清多糖浓度高，不利于纯化。,第四页，共28页。,昆虫细胞表达系统,利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。,优越性：,重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配；,可容纳较大片段的外源,DNA,插入，因此是表达大片段,DNA,的理想载体；,可进行分泌表达。,缺点：,糖基化与哺乳动物有所差别；,表达量有限；,作为药物宿主细胞未被,FDA,认可；,培养成本高。,第五页，共28页。,哺乳动物细胞表达系统,哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。,优越性：,糖基化与人源蛋白一致；,能表达天然结构的完整蛋白，活性很高；,可进行分泌表达。,缺点：,表达量低；,培养成本很高，操作繁琐。,第六页，共28页。,植物表达系统,优越性：,能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质。,易于大规模培养和生产。,在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势。,缺点：,不易,提取与纯化,第七页，共28页。,由于缓冲液浓度低于膜内部的浓度,因此在半透膜上会发生物质交换；,在BL21(DE3)细胞的基础上，具有额外拷贝的argU、ileY和leuW tRNA基因,pET载体表达蛋白流程,重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配；,4mM IPTG，按上述优化条件大量诱导表达靶蛋白。,加入1%Triton-X-100，冰中放置10min。,第二十三页，共28页。,2)中，磁力搅拌机上3h，更换至2M,2M Urea PBS(pH 7.,哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。,用于含有T7的pET系列载体构建质粒的蛋白表达,S:Lysis supertanant,BL21(DE3)是用得最多的表达菌,0,500mM NaCl,8M Urea)洗柱。,5ml 50%Ni-NTA His Bind Resin，自然沉降，无菌水冲洗，3ml binding buffer(+8M Urea)平衡。,在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势。,培养成本很高，操作繁琐。,Factors in,protein expression,Vector,Strain,Growth conditions,第八页，共28页。,原核表达载体众多，常用的有,pET(T7 promoter),、,pQE(T5 promoter),、,pGEX(GST,融合表达,),等。,各载体适应的菌株也不尽相同,pET(BL21(DE3),、,pQE(M15,JM109),、,pGEX(BL21),。,对于我们来说，最常用和最需掌握的是,pET,表达系统,表达载体,(Vector),第九页，共28页。,Expression plasmid features,第十页，共28页。,Lac operon,第十一页，共28页。,Induction of expression,第十二页，共28页。,原核表达宿主菌,名称,特征,用途,抗性,DH5,带有,recA endA,突变的克隆菌株，由于,DH5,具有,deoR,变异，可以作为较大质粒的宿主菌使用。,常用的质粒抽提工程菌株,可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。,无,BL21,lon,和,ompT,蛋白酶缺陷型,用于,PGEX,载体构建质粒的蛋白表达,无,BL21(DE3),lon,和,ompT,蛋白酶缺陷型，含有,lacI,抑制基因和位于,lacUV5,启动子下的,T7 RNA,聚合酶基因,用于含有,T7,的,pET,系列载体构建质粒的蛋白表达,无,BL21(DE3)-RP,在,BL21(DE3),细胞的基础上，具有额外拷贝的,argU,和,proL,基因,解决了表达富含,AT,的基因组蛋白密码子偏倚性问题,氯霉素,BL21(DE3)-RIL,在,BL21(DE3),细胞的基础上，具有额外拷贝的,argU,、,ileY,和,leuW tRNA,基因,解决了表达富含,AT,的基因组蛋白密码子偏倚性问题,氯霉素,BL21(DE3)-plysS,带有可以与,pET,共存的、编码,T7,溶菌酶（,T7 RNA,聚合酶的天然抑制物）的质粒。,pLysS,菌株在被诱导前,T7 RNA,聚合酶的基础表达被抑制，这样可以使表达会影响宿主细胞生长和活力的重组体在宿主中更稳定。带有,pLacI,质粒的宿主菌产生额外的抑制,pETBlue,和,pTriEx,载体基础表达的,lac,阻遏蛋白,更严格的本底表达控制，,适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。,氯霉素,BL21(DE3)-Rosetta-gami,（,Rosetta-gami,）携带,pRARE2,质粒的,BL21,衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（,AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA,及,CGG,）稀有密码子对应的,tRNA,，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，又具有,thioredoxin reductase(trxB),和,glutathione reductase(gor),两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达,补充,7,种稀有密码子，促进蛋白可溶性及表达活性,卡那霉素、氯霉素、四环素,Rosetta-Blue,带有,recA endA lacI,q,突变的克隆菌株,高蛋白表达,补充大肠杆菌缺乏的,AGG,AGA,AUA,CUA,CCC,GGA,六,种稀有密码子对应的,tRNA,。,补充稀有密码子，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平,氯霉素,第十三页，共28页。,所有,B,型菌株，,B834,，,BL21,，,BLR,，,Origami B,，,Rosetta,及,Tuner,都缺乏纯化过程中降解蛋白的,lon,蛋白酶及,ompT,外膜蛋白酶。因此，目的蛋白在这些菌株中的稳定性要高于带有这些蛋白酶的菌株。,BL21(DE3),是用得最多的表达菌,AD494(DE3),和,BL21,trxB,(DE3),具有,trxB,突变，而,Origami(DE3),，,Origami B(DE3),和,Rosetta-gami(DE3),菌株带有,trxB,和,gor,双突变。拥有,trxB,和,gor,突,变的菌株比单具,trxB,突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更,高,多数氨基酸有不只一个密码子，而不同的生物使用这,61,种密码子的偏好性不同。每种细胞里，,tRNA,种类和数量直接反映了其,mRNA,使用密码子的种类和数量的偏好性。当外源目的基因,mRNA,在里过表达，由于密码子偏爱性不同，会因为缺乏某种或某几种,tRNA,，直接导致翻译终止或错误。,tRNA,不足会造成翻译停顿，早期翻译停止，移码突变，和氨基酸错掺等问题。,Rosetta,菌株是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀有,tRNA,水平，这些蛋白的表达会大幅度提高。,第十四页，共28页。,表达条件,培养基,抗生素,诱导剂,诱导温度,诱导时机,诱导时间,第十五页，共28页。,载体对表达的影响,pET32,BL21(DE3),表达蛋白,:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD),pET43,BL21(DE3),表达蛋白,:Nus-His6-S Tag-EK-IFN(MW78KD),N I I I M I p s p s,M N I S P,U:Uninduced crude extract,I:Crude extract after induced,S:Lysis supertanant,P:Lysis precipitation,第十六页，共28页。,0.1mM IPTG,incubate for 16h at 16,0.1mM IPTG,incubate for 3h at 37,N I S P,N I S P,表达条件对表达的影响,pET21,BL21(DE3)-RIL,表达的蛋白,:His6-REIIBP(MW67KD),U:Uninduced crude extract,I:Crude extract after induced,S:Lysis supertanant,P:Lysis precipitation,第十七页，共28页。,增加可溶性和折叠,降低蛋白合成速率。,温度。,裂解缓冲液的性质。,融合标签,二硫键,第十八页，共28页。,pET,载体表达蛋白流程,制备,pET,载体,制备插入,DNA,将插入片段插入到,pET,载体上,转化表达宿主菌,诱导,/,优化表达目的蛋白,放大实验,纯化目的蛋白,第十九页，共28页。,蛋白抗体制备,第二十页，共28页。,多克隆抗体：,由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同抗原决定簇的抗体的混合物，即多克隆抗体。,单克隆抗体：,由单一,B,细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（,hybridoma,）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏,B,细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为,B,细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。,第二十一页，共28页。,据文献及,DNAstar,软件分析，确定各蛋白最可能抗原区序列，软件设计引物，从基因组，扩增目的基因。克隆至,pET28a,载体上。转化至,DH5a,中，经,PCR,验证重组子。重组子质粒再转化至,BL21(DE3),菌株中，进行小量诱导表达，确认最适条件后，进行大量诱导表达，提取大肠杆菌包涵体，溶菌酶处理，添加去垢剂，超声破碎后，溶于,8M Urea,中，经镍柱层析咪唑洗脱，过夜透析，无菌过滤后，免疫家兔，通过化学发光,Western,印迹确定多克隆抗血清的效价。,第二十二页，共28页。,抗原基因构筑：,通过设计的抗原序列,aa,的个数，加上载体上含组氨酸标签序列的,42aa,，计算是否达到抗体注射免疫家兔的要求（,17-25kDa,之间）,第二十三页，共28页。,诱导表达靶蛋白：,PCR,验证基因产物是否插入载体。转化至,DH5a,中测序，再转化至,BL21,中小量诱导表达各蛋白。探索蛋白表达最合适的条件，如温度、诱导时间、,IPTG,浓度。,0h 2h 4h 6h,第二十四页，共28页。,大量诱导表达，分离包涵体：,过夜培养,25ml,菌液，在,5,：,1,的锥形瓶,:,培养基中按,1,：,50,比例加入过夜菌液，,30-35,，,0.4mM IPTG,，按上述优化条件大量诱导表达靶蛋白。,5000g,15mi