《常用的生化反应》课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验四 常用的生化反应,1,实验目的,认识染色方法鉴别细菌的局限性,掌握几种常用生化反应的原理、方法和结果判断,2,实验菌种,产气肠杆菌（,Enterobacter arogenes）,大肠埃希菌（,Escherichia coli）,普通变形杆菌（,Proteus vulgaris）,铜绿假单胞菌（,Pseudomonas aeruginosa）,3,糖发酵试验,细菌对各种糖的分解能力及代谢产物不同，可借以鉴别细菌。一般非致病菌能发酵多种单糖，如大肠埃希菌能分解葡萄糖和乳糖，产生甲酸等产物，并有甲酸脱氢酶，可将其分解为,CO,2,和,H,2,，故生化反应结果为产酸产气，以“,”,表示。伤寒沙门菌分解葡萄糖产酸，但无甲酸脱氢酶，故生化结果为产酸不产气，以“,+”,表示。伤寒沙门菌不能分解乳糖，以“,-”,表示。,4,5,O-F,试验,将实验菌种接种到2支,O-F,管中,在其中1支管中加入无菌液体石蜡，厚度0.5,cm,左右。,35培养18-24小时。,结果,开口管 加石蜡管 结果,黄色 黄色 发酵型（,F）,黄色 绿色 氧化型（,O）,绿色 蓝色 产碱型,6,VP,试验,产气肠杆菌能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇被氧化（在碱性溶液中）生成二乙酰，后者可与含胍基的化合物反应生成红色化合物，称,VP,试验阳性。大肠埃希菌不能生成乙酰甲基甲醇，,VP,阴性。,VP,甲液：,5%,萘酚,VP,乙液：,40%KOH,7,8,甲基红试验,产气肠杆菌使丙酮酸脱羧后形成中性产物，培养液,pH,5.4,，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性，大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液呈酸性,pH,5.4,，,指示剂甲基红,呈红色，称甲基红试验阳性。,9,10,枸橼酸盐利用试验,能利用枸橼酸盐作为唯一碳源的细菌如产气肠杆菌，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，同时分解培养基的铵盐生成氨，由此使培养基变为碱性，使,指示剂溴麝香草酚蓝（,BTB,）,由淡绿转为深蓝，此为枸橼酸盐利用试验阳性。,11,12,吲哚试验（靛基质）,含有色氨酸酶的细菌（如大肠埃希菌、变形杆菌等）可分解色氨酸生成吲哚（靛基质），若加入对二甲基氨基苯甲醛，与吲哚结合形成玫瑰吲哚，呈红色，称吲哚试验阳性。,13,14,硫化氢试验,变形杆菌、乙型副伤寒沙门菌等能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢。在有醋酸铅或硫酸亚铁存在时，则生成黑色硫化铅或硫化亚铁，可借以鉴别细菌。,15,16,尿素分解试验,变形杆菌具有尿素酶，可分解尿素产生氨，培养基呈碱性，以酚红为指示剂检测呈红色。,17,阳性,阴性尿素酶试验,18,1.,什么是传统机械按键设计？,传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动,PCBA,上的开关按键来实现功能的一种设计方式。,传统机械按键设计要点：,1.,合理的选择按键的类型，尽量选择平头类的按键，以防按键下陷。,2.,开关按键和塑胶按键设计间隙建议留,0.050.1mm,，以防按键死键。,3.,要考虑成型工艺，合理计算累积公差，以防按键手感不良。,传统机械按键结构层图：,按键,开关键,PCBA,吲哚（,I,）、甲基红（,M,）、,VP,（,V,）、枸橼酸盐利用（,C,）四种试验，常用于鉴定肠道杆菌，合称之为,IMViC,试验,。,大肠埃希菌呈“,+-”,，产气肠杆菌为“,-+”,。,20,硝酸盐还原试验,原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。,21,硝酸盐还原的过程因细菌不同而异:,有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；,有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；,有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞菌等。,硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝酸。,22,试剂：甲液 对氨基苯磺酸,乙液,-,奈胺,结果：出现红色为阳性。,若加入试剂后无颜色反应，可能是：硝酸盐没有被还原，试验阴性；硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。,若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒管，如有气泡产生，表示有氮气生成。,23,过氧化氢酶试验(触酶试验),原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。,试剂：3过氧化氢溶液。,方法：取待测菌涂在玻片上，然后加3过氧化氢数滴立即观察结果。,结果：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。,24,氧化酶试验,原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素,C,氧化，再由氧化型细胞色素,C,使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。,试剂：1盐酸四甲基对苯二胺或1盐酸二甲基对苯二胺。,方法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。,结果：细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。,25,克氏双糖铁琼脂（,KIA,）,葡萄糖,乳糖,110,铁：枸橼酸铁铵,指示剂：酚红,我们人为的把高层代表葡萄糖，斜面代表乳糖。,26,葡,（）,葡,（）,葡,（）,葡,（）,乳,（）,乳,（）,乳,（）,H,2,S,（）,乳,（）,克氏双糖铁琼脂（,KIA,）,27,原理,以葡萄糖，乳糖为例葡萄糖是最早利用的单糖，发酵葡萄糖的中间产物丙酮酸为酸性，酚红指示剂为黄色。,28,斜面,1,、斜面生长的菌量多，面积大，跟氧分子接触的面积也大氧化丙酮酸,CO,2,H,2,O,中性，,PH,不变,2,、斜面蛋白质被细菌利用，氨基酸被利用产生,NH,3,，碱性，酚红指示剂为红色。,29,高层,高层中丙酮酸浓度高，跟氧分子接触少，在,24,小时内不会被氧化，因此仍为黄色。,30,结果,高层黄色斜面红色,31,如葡萄糖，乳糖，则高层与斜面均为黄色（,24,小时内）。,如果延长培养时间，高层中的丙酮酸也会进一步氧化，同时细菌利用蛋白质后产碱性物质越来越多，则高层也会变为红色。,32,有些细菌能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢,H,2,S,Fe,黑色的硫化亚铁,33,问：有无葡萄糖，乳糖的情况？为什么？,34,MIU,试验,半固体,M,代表动力,I,代表吲哚（靛基质）,U,代表尿素,结果观察时先观察有无动力，试验管有无变红（三分之二管变红为尿素阳性），然后加入对二甲基氨基苯甲醛，观察吲哚试验结果。,35,思考题：,KIA,的试验原理,36,实验内容,1、用革兰染色法观察四种试验细菌的形态学特征,2、将四种试验细菌接种各种生化反应管：,O-F,管2支，,KIA、MIU、,硝酸盐还原各1支，葡萄糖磷酸盐蛋白胨水2支。接种完毕放置35培养18-24小时。,3、过氧化氢酶试验、氧化酶试验,注：以组为单位做四株试验菌，每位同学做一株菌。,37,