实验八 细胞内溶酶体和线粒体的荧光标记

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,细胞内溶酶体,和线粒体的荧光活体染色,实验原理,Mito-Tracker Green,是一种线粒体,(mitochondria),绿色荧光探针，可以用于活细胞线粒体特异性荧光染色。,Mito-TrackerGreen,为采用,MolecularProbes,公司的,carbocyanine,进行了荧光标记的一种,Mito-Tracker,，分子量为,671.88,，可以用作线粒体特异性的荧光探针。和,rhodamine123,或,JC-1,相比，,Mito-Tracker Green,对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位。,实验原理,Lyso-Tracker Red,是一种溶酶体,(lysosome),红色荧光探针，可以用于,活细胞,溶酶体特异性荧光染色。,Lyso-Tracker Red,为采用,Molecular Probes,公司的,DND 99,进行了荧光标记的带有,弱碱性,的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于,溶酶体的特异性荧光,标记。中性红,(NeutralRed),和吖啶橙,(Acridine Orange),也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。,1.,实验目的,掌握荧光显微镜工作的原理,了解细胞器在细胞内的分布,了解荧光染料的使用方法,Lyso-Tracker Red,工作液的配制：,a.,取少量,Lyso-Tracker Red,按照,1:13333-1:20000,的比例加入到细胞培养液或适当的溶液,(,例如含钙镁离子的,HBSS),中，使,最终浓度为,50-75nM,。例如取,1,l Lyso-Tracker Red,加入到,20ml,或,13.33ml,细胞培养液或适当的溶液,(,例如含钙镁离子的,HBSS),中。,2.,溶酶体的荧光标记：,a.,去除细胞培养液，加入步骤,1,配制好的并,28,预温育的,Lyso-Tracker Red,染色工作液，与细胞,28,共孵育,30,分钟,。,b.,去除,Lyso-Tracker Red,染色工作液，加入,500,微升预温的新鲜的细胞培养液或,PBS,漂洗。,c.,取出盖玻片，在载玻片上滴一滴,PBS,，将盖玻片反扣在载玻片上，荧光观察,d.,用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到溶酶体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高,Lyso-Tracker Red,染色工作液中,Lyso-Tracker Red,的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。,使用说明：,1.Mito-Tracker Green,储存液的配制：,用无水,DMSO(anhydrous dimethylsulfoxide),配制,Mito-Tracker Green,至终浓度为,1mM,。配制后可以,-20,或更低温度避光保,存。,2.Mito-Tracker Green,工作液的配制：,a.,取少量,1mM Mito-Tracker Green,储存液按照,1:5000-1:50000,的比例加入到细胞培养液或适当的溶液,(,例如含钙镁离子的,HBSS),中，使最终浓度为,20-200nM,。例如取,1,l Mito-Tracker Green,加入到,50ml,或,5ml,细胞培养液或适当的溶液,(,例如含钙镁离子的,HBSS),中。混匀后即为,Mito-Tracker Green,工作液。,HBSS with Ca2+&Mg2+(C0219),可以向碧云天订购,。,b.Mito-Tracker Green,工作液使用前需,28,预温育。,注：工作液中,Mito-Tracker Green,的浓度可以根据实际情况进行适当调整。为降低背景，在染色效果可以接受的范围内，建议尽量使用较低浓度的,Mito-Tracker Green,。,3.,线粒体的荧光标记：,a.,去除细胞培养液，加入步骤,2,配制好的并,28,预温育的,Mito-Tracker Green,染色工作液，与细胞,28,共孵育,15-45,分,钟。,b.,去除,Mito-Tracker Green,染色工作液，加入,500,微升,28,预温育的新鲜细胞培养液或,PBS,漂洗。,c.,取出盖玻片，在载玻片上滴一滴,PBS,，将盖玻片反扣在载玻片上，荧光观察,。,d.,用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到线粒体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高,Mito-Tracker Green,染色工作液中,Mito-Tracker Green,的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。,1,打开可将光和激发光光源（预热,10,分钟）,2,遮光板遮住激发光,3,选择“,1”,，在可见光下，聚焦，观察清晰图像，再调到高倍镜下，微调至清晰,4,关掉可见光光源，打开遮光板，让激发光透过,5,选择“,G”,观察红色荧光,6,选择“,B”,观察绿色荧光,