大肠菌群检验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,一、大肠菌群的食品卫生学意义,1、作为粪便污染食品的指标菌,有来源特异性，即仅来自肠道。,在肠道中的数量较多，易于检出。,在外环境中有足够的抵抗力，能生存一定期间。,食品细菌学检验方法敏感、特异。,2、作为肠道致病菌污染食品的指标菌。,二、大肠菌群的定义及检测方法,1、大肠菌群的传统定义,大肠菌群（,Coliform,group）,系指一群需氧及兼性厌氧，在37,24,小时能,发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。,包括肠杆菌科的艾希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属。其中以艾希氏菌属为主，称为典型大肠杆菌，其它三属习惯上称为典型大肠杆菌。,2、大肠菌群检验的标准方法,（1）最近拟数法（,MPN）（GB4789.2-1994）,样品,0.1,g3,0.01,g 3,0.001,g 3,乳糖胆盐发酵管,37,24hr,产酸产气管,伊红美蓝平板（分离）,37,24hr,可疑菌落,乳糖发酵管（证实）,37,24hr,根据经证实的乳糖胆盐发酵管,阳性管数，查,MPN,表。,（2）平板直接计数法（,SN0169-92）,样品,0.1,g2,0.01,g 2,0.001,g 2,结晶紫中性红胆盐琼脂（,VRBA）37,24hr,计数紫红色菌落，乘以稀释倍数报告,3、,ISO,关于大肠菌群的定义（,ISO9308-1：2000）,（ISO：INTERNATIONAL STARDIZATION ORGANIZATION,国际标准化组织）,大肠菌群是革兰氏阴性、无芽孢、氧化酶阴性的杆状细菌，可需氧或兼性厌氧地生长在含胆盐（或其他具有同样抑制生长性能的表面活性剂）的培养基上，当在36 2,培养时，,通常能于48,hr,内发酵乳糖产酸和醛。它们还具有,-,半乳糖苷酶。,4、依据,-,半乳糖苷酶快速测定大肠菌群的原理,大肠菌群产生的,-,半乳糖苷酶可分解培养基中的酶底物（即色基与,-,半乳糖的结合物），使带色基团游离而显色或发荧光。该反应灵敏快速。,测定,-,半乳糖酶常用的底物有4-甲基伞形酮-,-D,半乳糖苷（,MUGal,）、5-,溴-4氯-3-吲哚-,-D-,半乳糖苷（,X-gal）、3，4-,环已酮-,-D-,半乳糖苷和8-羟基喹啉-,-D-,半乳糖苷等。,1993年,Brenner,等人用加,4-甲基伞形酮-,-D-,半乳糖苷（,MUGal,）,和吲哚氧基-,-D-,葡糖醛酸苷的培养基检测大肠菌群和大肠杆菌3，取得满意结果。1995年该方法被美国国家环境保护署采纳（,Code of Federal Regulation 40,141.21 Protection Of Environment）。,美国,SIGMA,公司有商品化试剂，但价格昂贵。,2000年,James,等独家报导了一种新的检测大肠菌群的酶底物,茜素-,-D-,半乳糖苷（,Aliz,-gal）,。,该试剂具有比同类酶底物更灵敏的性能，在固体培养基中可使大肠菌群呈现带色菌落，色素为脂溶性不扩散，易与辨别，另还,可以和不同的阳离子（,Fe、Al、K、NH4）,形成带色的螯合物，这样就便于和其他的显色剂合用，组成具有多种性能的鉴别培养基，以提高检测的灵敏度。目前，国内外均无商品化试剂出售。,三、应用4-甲基伞形酮-,-D-,半乳糖苷快速检验食品中的大肠菌群,1、检测步骤,样品,0.1,g3,0.01,g 3,0.001,g 3,MUGal,肉汤,37,24hr,在紫外光下观察产荧光管数，查,MPN,表得,MPN,值,大肠菌群,-D-,半乳糖苷酶,4-甲基伞形酮-,-D-,半乳糖苷 4-甲基伞形酮（兰色荧光）,MUGal,肉汤,：,胰蛋白胨20,g,氯化钠5,g,无水磷酸氢二钾2.75,g,无水磷酸二氢钾2.75,g,月桂基硫酸钠0.1,g,MUGal,0.08g,水1000,ml,加热使溶化，调,Ph7.4，,分装试管，每管10,ml，116,高压灭菌10,min。,待培养基冷却后，以无菌手续在每管培养液内加入0.1,mL,经过滤除菌的500,ug,/,mL,头孢磺啶,稀释液。,2、试验情况简介,当在,MUGal,肉汤中生长的大肠菌群数量较少时也可在紫外灯下呈现明显的蓝色荧光，反应较乳糖产酸显色快速灵敏，结果易读。,以13株与肠杆菌科相关的标准菌株验证,MUGal,肉汤，其结果与在,LST,和乳糖胆盐肉汤中的乳糖发酵结果完全一致，符合相关菌株的特性。,将自制,MUGal,与,SIGMA,产,MUGal,比较测试26份样品，两者阳性符合率为94.6%。,以自制,MUGal,肉汤与,LST,肉汤比较检测66份样品中大肠菌群，其24,h,阳性检出率是,LST,肉汤48,h,的1.5倍，但延长,LST,肉汤培养时间至96小时后，两者结果逐步接近。表明,MUGal,多检出的阳性部分多为受伤生长缓慢或迟缓发酵乳糖的大肠菌群类菌株所致。,将,MUGal,肉汤阳性管中的可疑菌株进行触酶、氧化酶和硝酸盐还原试验，并任选其中18株用,API 20E,鉴定。证明95.1%的,MUGal,肉汤阳性管中含有大肠菌群。,综上所述，自制,MUGal,肉汤检测大肠菌群灵敏、快速、准确，无需验证，可一次完成。自制,MUGal,性质稳定，无游离荧光，可替代昂贵的进口产品使用。鉴于以,MUGal,检测大肠菌群的方法早在1995年即为美国国家环境保护署采纳，有关大肠菌群具有,-,半乳糖苷酶的特性，也在,ISO 9308-1:2000,给予了明确的定义。因此，经过本次试验我们认为，以,MUGal,肉汤快速检测食品中大肠菌群作为一种推荐的标准方法加以应用是可行的。,四、应用茜素-,-D-,半乳糖苷快速检验食品中的大肠菌群,1、检测步骤,样品,0.1,g2,0.01,g 2,0.001,g 2,Aliz,-gal,琼脂,37,24hr,计数紫色和红色菌落，乘以稀释倍数报告,大肠菌群,-D-,半乳糖苷酶,茜素,-,-D-,半乳糖苷,茜素,Fe.NH4.Al.K,（,紫色和红色,）,茜素-,-D-,半乳糖苷琼脂（,Alig,-gal,琼脂）：,Aliz,-gal,50,mg,蛋白胨20,g,无水磷酸氢二钾2.75,g,无水磷酸二氢钾2.75,g,氯化钠5,g,月桂基硫酸钠0.1,g,异丙基硫代半乳糖苷0.03,g,硫酸铝钾0.5,g,柠檬酸铁铵0.5,g,琼脂15,g,蒸馏水1000,mL,。,调,Ph7.4,2、试验情况简介,Aliz,-gal,检测食品中大肠菌群可在18-24,h,内显示出半乳糖苷酶反应，在同类性质的酶底物中，,Aliz,-gal,的用量较低，做倾注培养时在琼脂深层菌落特征较明显。,由于采用测定,-,半乳糖苷,酶的方法易于检出迟缓发酵乳糖的大肠菌群和厌氧大肠杆菌。所以，,本试验与4-甲基伞形酮-,-D-,半乳糖苷试验所得阳性结果都比各自的对比培养基的高。,试验证明用,Aliz,-gal,作,-,半乳糖苷酶底物以平板直接计数检测食品中的大肠菌群，具有特异性强、速度快、准确率高、结果稳定的特点，可作为标准方法加以应用。,