SNP-检测方法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单核苷酸多态性SNP,林壹明,2023/5/9,主要内容,一、SNP概念、分类与特点,二、SNP检测技术,三、SNP争论现状,四、SNP应用前景,SNP(single nucleotide polymophism)即单核苷酸多态性，是指群体中变异频率大于1%的单个核苷酸转变而导致的核酸序列多态性，包括转换、颠换、缺失和插入。但是比较常见的是转换和颠换，大约占80%。,一般来说，一个 SNP 位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。SNP在人基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。,SNP概念,SNP分类,依据在基因中的位置，SNP 可分为基因编码区SNP(coding SNP,cSNP)、基因内含子区SNP和基因调控区SNP(regulatory SNP,rSNP)。,其中cSNP依据是否转变编码的氨基酸又可分为同义cSNP(synonymous cSNP)和非同义cSNP(non-synonymous cSNP)。,SNP的主要特征,一、密度高。SNPs 在人类基因组中的总数超过300万。,二、遗传稳定性好。,三、分布不均匀。非编码区的数目远远大于编码区的数目。,四、具有代表性。,五、分析易自动化。由于每个SNP 位点通常仅含两个等位基因双等位基因(biallele)，在检测时能通过一个简洁的“+/”分析进展基因型分型，而无需分析片段的长度，因而易于自动化。,SNP检测技术,抱负的检测SNPs的方法,觉察未知的SNPs，或检测的SNPs,必需具备以下优点:,(1)适合自动化操作,简便、快速;,(2)分析费用低,特殊试剂用量少;,(3)反响要严紧,即使不纯的样品也可得到牢靠的结果;,(4)数据分析简洁,易于自动化分析;,(5)反响的通量要大而灵敏,一天可以完成几百，甚至到上百万个样品的检测与分析。,现在常用的SNP检测技术：,1.基于杂交的方法,2.基于酶的方法,3.电泳法,4.直接测序法,另外还包括化学法如高锰酸钾法，物理法例如基质帮助的激光吸附离子化飞行时间质谱分析等。,1.基于杂交的方法,原理:,短的核苷酸探针在和互补的目的片段进展杂交时，在完全匹配和有错配两种状况下，依据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs 位点检测出来。Tm差异越大，检测的特异性就越好,分为：(1利用Tm；,(2杂交+荧光探针。,(1)利用Tm,固定,温度,等位基因特异核苷酸探针(Allele-specific oligonucleotide，ASO)。,修饰过的探针：引入一个错配的碱基、,PNA,、,LNAs,等,动态,的加热过程,动态等位基因特异杂交(dynamic allele-specific hybridization,DASH,),核酸肽探针Peptide nucleic acids，PNA),其骨架是肽键,特点：,1、与靶分子高特异性地结合3个方面的影响；,2、链挤入 形成三链复合构造表达调控以及反义治疗方面；,3、对核酸酶和蛋白酶均不敏感体外应用。,与靶分子高特异性地结合,Tm值高,受盐浓度影响小低盐浓度的体系,Tm更大一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20度,所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好的排解。,LNA(locked nucleic acids),其构造是在RNA分子的2羟基和核糖环的4碳原子间连入一个亚甲基的“桥”。,特点：,1.能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA 或LNA 结合构象更利于杂交的稳定,2.匹配和不匹配之间的Tm增加,DASH(dynamic allele-specific hybridization,2杂交+荧光探针,分子信标双分子间杂交,分子信标Molecular beacons,是在样品PCR过程中因和样品DNA 杂交后而使自身荧光构象转变从而实现SNP的检测。,分子信标是一种新型的发夹构造的寡核苷酸探针,2.基于酶的方法,1DNA聚合酶,2连接酶,3限制性内切酶,4外切酶FEN,5RNase H,DNA聚合酶法,Taqman法,单碱基延长法,焦磷酸测序法,此类方法是依据PCR 过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对SNP位点的检测,是基于以下两点:,(1)错配消逝在引物中部时致使稳定性降低,在严格杂交条件下将不能退火;,(2)错配消逝在引物3端时,引物将不能延长。,因此针对不同等位基因设计平行引物,上游引物的3端和多态性位点互补,这样只有和引物完全互补的序列才能得到扩增,不同的等位基因依靠于所使,用的不同引物分别得以扩增。产生的PCR 产物可以通过凝胶电泳或实时,的荧光测定来实现对其的分析。,Taqman 法,优点：闭管进展，,削减污染。,缺点：淬灭难以彻底，,本底较高。,单碱基延长法single base extension),根本步骤,1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA。,2.对PCR产物进展纯化去除引物和dNTP)。,3.引物延长。,4.延长产物检测放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为根底的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液相色谱法等。,焦磷酸测序法(Pyrosequencing),原理：DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进展引物延长反响,而引物的成功延长将伴随焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种化学发光反响,通过发光计的实时监测来到达检测的目的。,根本步骤,1.测序引物和DNA模板杂交PCR扩增的、单链的，与酶和底物孵育。,2.四种dNTPdATPS，dTTP，dCTP，dGTP之一被参与反响体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团PPi释放出来。,3.一系列的酶学反响，发出可见光信号。每个光信号的峰高与反响中掺入的核苷酸数目成正比。,4.ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反响体系。,5.然后参与下一种dNTP。,3.电泳法,电泳法：就是利用电泳的方法对含有SNP的寡核苷酸链进展分别检测的技术。,SSCP单链构象多态性single strand conformation polymorphism,DGGETGGE变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,SSCP单链构象多态性single strand conformation polymorphism,原理：非变性条件下，单链DNA(singlestranded DNA，简称ssDNA)链内碱基发生卷曲而形成一个较稳定的空间构象，DNA序列的转变会使卷曲DNA分子构象发生变化，所以，有序列差异的DNA分子通过非变性凝胶时，由于构象不同，所受到的阻力大小也就不同，结果是涌动速度的不同，从而到达分别的目的。,1.内切酶降解DNA样品，然后做变性处理；,2.在非变性电泳上进展电泳。,但是，该方法的区分率较差。,4.直接测序法,直接测序法：该方法是将获得的DNA序列直接进展测序，然后与标准的序列进展比对，对序列中的SNP进展检测的方法。,该方法检测力气一般，而且由于本钱比较高，不适合大规模筛查SNP。,SNP争论现状,一、SNPs 数据库；,二、基于SNPs 争论的单倍型图谱准备(Haplotype Map Project；,三、SNPs 在简洁疾病争论中的现状。,SNPs 数据库,SNPs 是伴随着HGP 进展起来的，HGP 的快速进展为SNPs 的应用供给了可行性，而鉴定人类DNA 序列的差异，查找基因组中更多的SNPs 是HGP 下一步的重要目标。,目前，不同基因的具体SNP 图谱渐渐被完成。,常用的SNPs数据库,NCBI dbSNP是主要的SNPs数据库，由美国国立生物技术信息中心(NCBI)和国家人类基因组争论所(NHGRI)共同组建；,TSC 数据库，由SNP 国际协会建立；,JSNP 数据库，始建于2023 年4 月，是由人类基因组中心(HGC)、医学科学争论院(IMS)、东京大学、日本科技公司(JST)合办。,基于SNPs 争论的单倍型图谱准备,查找标记SNPs 的国际遗传变异图谱准备，即国际单倍型图谱准备(Haplotype Map Project)已于2023 年10 月正式启动，2023 年中国担当了“国际单倍型图谱准备”10%的任务。,HapMap 准备的目标在于，确定人类基因组中一般模式的DNA 序列变异，通过测定序列变异特征、变异频率、它们之间的关联，绘出人类基因组的单倍型块，以及不同单倍型块的标记SNPs。,SNPs 在简洁疾病争论中的现状,SNPs 由于其分布广、密度高而被期望在诸如癌,症、糖尿病、高血压、愁闷症和哮喘等简洁疾病,的争论中起重要作用。,上述疾病是多个遗传变异位点与环境因子共同作用的结果，由于发病缘由简洁，涉及的基因数量多，已成为国际上疾病基因组学争论的重点，我国国家基因组南方中心已对鼻咽癌等多种疾病开放深入争论，建立了家系收集网络，取得了确定进展。,国内争论者在单个基因的SNPs与疾病相关性方面进展了大量争论。如应用实时荧光技术分析N-乙酰基转移酶基因多态性与肝癌易感性的关系，结果说明，携带N-乙酰基转移酶基因慢乙酰化基因型的吸烟者可能是肝癌的高危人群。,目前已有试验将SNPs 应用于肿瘤预后及易感性的推断。如日本学者觉察了HER-2 基因编码区的一个SNP 与胃癌的进展及恶性程度有关。,SNP应用前景,1、人类学争论中的应用：人类进化、不同人群、民族之间的关系、人类的起源、人类的迁移等例如Y染色体SNP分型。,2、遗传病的诊断和疾病的关联分析。,3、疾病相关基因的定位和克隆。,4、法医学中的个体识别和亲权鉴定。,5、个体化疾病预防，真正进入预防医学时代。,6、药物基因组学的应用：新药设计与制造，个体化疾病治疗与用药。,Thank you!,