黄酮类成分分析分析课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,黄酮类成分分析,黄酮类成分分析,1,一、结构特征及理化性质,结构特征,基本母核：,2-,苯基色原酮（,C,6,-C,3,-C,6,）,理化性质,物理性状,结晶性固体或无定形粉末。大多数呈黄色，其颜色的有无与交叉共,轭体系有关。如：黄酮、黄酮醇及其苷类多呈黄色；二氢黄酮、二,氢黄酮醇及黄烷醇呈无色；异黄酮呈无色或微黄色。,溶解性,游离苷元,易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶及稀碱水,黄酮苷,易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂,O,O,一、结构特征及理化性质游离苷元易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、,2,酸碱性,酸性：与酚羟基的数目和位置有关,7,4-,二羟基,7,或,4-,羟基,一般酚羟基,5-,羟基,碱性：,r-,吡喃酮环上的,1-,位氧原子，可表现出微弱碱性,显色反应,还原反应（盐酸镁粉反应）,与金属盐类试剂的配合反应（铝、铅、锆、镁盐）,硼酸显色反应碱性试剂反应,五氯化锑反应,Gibbs,反应和,Emerson,反应,光谱特征,I,带,(300-400nm)B,环桂皮酰基,II,带,(240-285nm)A,环苯甲酰基,酸碱性,3,黄酮类成分分析分析课件,4,色谱法,1.,薄层色谱法,硅胶,-,分离鉴别弱极性黄酮类化合物,遵循正相色谱原理，化合物极性越大，所选择的展开剂极性也相应增大，同时根据化合物酸性强弱调节展开剂的酸碱性。常用展开剂有苯,-,甲醇等。,聚酰胺,-,分离检识含游离酚羟基的黄酮及其苷,利用氢键吸附原理，由于聚酰胺和黄酮类化合物上酚羟基形成氢键缔合，所以作用力较强，需要极性强的展开剂，而在展开剂中大多含有醇、酸或水，或兼有两者。所以，分离检识游离黄酮常用有机溶剂作为展开剂，如氯仿,-,甲醇等；而分离检识黄酮苷常用含水有机溶剂作为展开剂，如甲醇,-,水等。,纤维素,-,分离黄酮类多糖苷混合物,展开系统：正丁醇,-,乙酸,-,水，,5%40%,乙酸,展开好的色谱，常在紫外灯（,365nm,）下观察荧光斑点及其颜,色；亦可喷三氯化铝试剂，在日光灯或紫外灯下观察荧光是否加,强；也可氨熏，是否出现黄色、棕色荧光斑点等。,色谱法,5,2.,纸色谱法,适用于分离各种类型的黄酮化合物，包括游离黄酮和黄酮苷类。,混合物的检识常采用双向色谱法，第一向采用醇性展开剂如正丁醇,-,乙酸,-,水（,4:1:5,上层，,BAW,）等，此为正相分配色谱，极性小的化合物比极性大的化合物,R,f,值大。第二向采用水性展开剂，如水、,2%6%,乙酸等，其色谱行为类似于反向色谱，极性大的化合物比极性小的化合物,R,f,值大。,游离黄酮类化合物的检识，一般宜用醇性展开剂；花色素及花色苷的检识可用含盐酸或乙酸的水溶液作展开剂。,多数黄酮类化合物在纸色谱上用紫外灯检查时，可以看到有色点，以氨蒸气处理后常产生明显的颜色变化。此外，还可以喷以,2%AlCl,3,甲醇溶液（在紫外灯下检查）或,1%FeCl,3,-1%K,3,Fe(CN),6,(1:1),水溶液等显色剂。,2.纸色谱法,6,三、含量测定,中药制剂中含有黄酮类成分，可按要求测定总黄酮含量、黄酮类单,体含量或两者均须测定。含量测定方法主要有分光光度法、薄层色谱法、,高效液相色谱法等。,（,一）、总黄酮含量测定,1.,分光光度法一般用于总酮类成分的含量测定。大多数黄酮类化合,物在甲醇溶液中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成。,带,出现在,300400nm,之间的吸收带,带,出现在,240285nm,之间的吸收带,含黄酮类化合物的原料药及部分制剂经必要的提取纯化后，可直接,于最大吸收波长附近测定总黄酮的吸光度，对照品的选定应以最大吸收,波长与总黄酮的相近为原则，单体黄酮和总黄酮均可作为对照品，常以,芦丁等对照品计算总黄酮的含量。,中国药典,2015,版中淫羊藿总黄酮的含量测定（书,P156,页）,三、含量测定,7,2,.,铝盐配位比色法,本法采用分光光度法测定中药中黄酮类成分，若供试液中其他组分的吸收存在干扰，可进行比色测定。该法利用黄酮类成分与铝盐发生配位反应，生成的配合物与背景最大吸收波长差别较大，可消除背景（即阴性空白）的干扰，显著提高含量测定的选择性。,（,1,）硝酸钠,-,硝酸铝,-,氢氧化钠比色法,将中药通过适当方法制成供试液,加,5%,亚硝酸钠反应,6min,10%,硝酸铝反应,6min,4%,氢氧化钠反应,15min,生成红色配合物后在,500nm,测定，常用芦丁作为对照品。,（：该法是基于邻二酚羟基的反应，并非黄酮类化合物的专属反应。）,垂盆子颗粒中总黄酮含量测定,铝盐配位比色法（见书,156,页）,（,2,）三氯化铝,醋酸钾比色法,常用芦丁为对照品，采用三氯化铝,醋酸钾为显色剂，显色后在,420nm,波长处测定黄酮类成分含量。,(p S,:,黄酮类化合物与三氯化铝,醋酸钾反应后最大吸收波长并不一定都,在,420nm,处，因此，最好用所含黄酮作对照品）,消咳喘糖浆中总黄酮含量测定,-,铝盐配位比色法 见书,p157,页,2.铝盐配位比色法,8,（二）、单体黄酮含量测定,薄层扫描法,样品经适宜的溶剂提取得到供试液，经硅胶、聚酰胺或纤维素薄层,色谱有效分离后，用薄层扫描仪直接进行含量测定。对黄酮类单体,既可以进行紫外,-,可见光扫描，又可以进行荧光扫描。,高效液相色谱法,正相色谱,(,多用于没有羟基或乙酰化黄酮类成分化合物）,固定相为硅胶，流动相可套用薄层色谱条件，但极性要相对小一点。,反相色谱（,C,18,或,C,8,）,固定相多为十八烷基硅烷键合相,流动相：甲醇,-,水,-,乙酸（磷酸缓冲液），乙腈,-,水,检测器：紫外检测器或荧光检测器,（二）、单体黄酮含量测定,9,银杏叶提取物,总黄酮醇苷,含量,测定,含量测定,色谱条件与系统适用性试验,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇,-0.4%,磷酸溶液（,50,：,50,）为流动相；检测波长为,360nm,。理论板数按槲皮素峰计算应不低于,2500,，山柰素酚峰与异鼠李素峰的分离度应大于,1.5,。,对照品溶液的制备,（略）,供试品溶液的制备,取本品,10,片，除去包衣，精密称定，研细，取约相当于总黄酮醇苷,19.2mg,的粉末，精密称定，精密加入甲醇,20ml,，称定重量，超声处理,20,分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液,10ml,，置,100ml,锥形瓶中，加甲醇,10ml,、,25%,盐酸溶液,5ml,，摇匀，置水浴中加热回流,30,分钟，迅速冷却至室温，转移至,50ml,量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（,0.45,m,）滤过，取滤液，即得。,测定法,分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各,10,l,，注入液相色谱仪，测定，分别计算槲皮素、山奈素和异鼠李素的含量，按下式换算成总黄酮苷的含量。,总黄酮醇苷含量,=,（槲皮素含量,+,山奈素含量,+,异鼠李素含量）,2.51,银杏叶提取物总黄酮醇苷含量测定,10,中药名称,主要黄酮类成分,黄芩,黄芩苷，黄芩素，汉黄芩苷，汉黄芩素，千层纸素,槐米,芦丁，槲皮素,葛根,葛根素，大豆苷,陈皮,橙皮苷，川陈皮素，新橙皮苷，橘皮素,枳实,橙皮苷，川陈皮素，新橙皮苷，5-邻-去甲基川陈皮素,山楂,槲皮素，金丝桃苷,淫羊藿,淫羊藿苷，淫羊藿次苷，槲皮素,射干,次野鸢尾黄素，野鸢尾苷,补骨脂,补骨脂查尔酮，异补骨脂查尔酮,常见的黄酮类成分分析,p158p159,中药名称主要黄酮类成分黄芩黄芩苷，黄芩素，汉黄芩苷，汉,11,中药名称,:,葛根,成分,:,葛根素,定性鉴别方法：,取本品粉末,0.8g,，加甲醇,10ml,，放置,2,小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇,0.5ml,使溶解，作为供试品溶液。另取葛根对照药材,0.8g,，同法制成对照药材溶液。再取葛根素对照品，加甲醇制成每,1ml,含,1mg,的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则,0502,）试验，吸取上述三种溶液各,10l,，分别点于同一硅胶,G,薄层板上，使成条状，以三氯甲烷,-,甲醇,-,水（,7,：,2.5,：,0.25,）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（,365nm,）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光条斑。,理化特征：,溶于甲醇，略溶于乙醇，微溶于水，三氯甲烷或乙醚中不溶。,Mp:187,（分解）,UV:254nm,常用分析方法：,HPLC;TLCS;,紫外分光光度法,中药名称:葛根,12,中药名称,：槐花,成分,：芦丁,定性鉴别方法,：,取本品粉末,0.2g,，加甲醇,5ml,，密塞，振摇,10,分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取芦丁对照品，加甲醇制成每,1ml,含,4mg,的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则,0502,）试验，吸取上述两种溶液各,10l,，分别点于同一硅胶,G,薄层板上，以乙酸乙酯,-,甲酸,-,水（,8,：,1,：,1,）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，待乙醇挥干后，置紫外光灯（,365nm,）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。,理化性质,：易溶于碱水；可溶于热水、甲醇、乙醇、吡啶；微溶于丙酮、乙酸乙酯；难溶于冷水、苯、乙醚、三氯甲烷。,Mp:177178 ;UV:259,266,299,359nm,常见分析方法,：,HPLC;TLCS;,紫外分光光度法,中药名称：槐花,13,中药名称,：黄芩,成分,：黄芩苷,定性鉴别方法,：取本品粉末,1g,，加乙酸乙酯,-,甲醇（,3,：,1,）的混合溶液,30ml,，加热回流,30,分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇,5ml,使溶解，取上清液作为供试品溶液。另取黄芩对照药材,1g,，同法制成对照药材溶液。再取黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品，加甲醇分别制成每,1ml,含,1mg,、,0.5mg,、,0.5mg,的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则,0502,）试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各,2l,及上述三种对照品溶液各,1l,，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯,-,乙酸乙酯,-,甲醇,-,甲酸（,10,：,3,：,1,：,2,）为展开剂，预饱和,30,分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯（,365nm,）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显三个相同的暗色斑点。,理化性质,：,易溶于二甲基甲酰胺、吡啶，微溶于热冰乙酸、碳酸氢钠和氢氧化钠等溶液，难溶于甲醇、乙醇、丙酮，几乎不溶于水、乙醚、苯、三氯甲烷。,Mp:233 UV:242,272,310nm,常见分析方法,：,HPLC,TLCS,中药名称：黄芩,14,中药名称,：淫羊藿,成分,：淫羊藿苷,定性鉴别方法,：,取本品粉末,0.5g,，加乙醇,10ml,，温浸,30,分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇,1ml,使溶解，作为供试品溶液。照薄层色谱法（通则,0502,）试验，吸取供试品溶液和,含量测定,淫羊藿苷项下的对照品溶液各,10l,，分别点于同一硅胶,H,薄层板上，以乙酸乙酯,-,丁酮,-,甲酸,-,水（,10,：,1,：,1,：,1,）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（,365nm,）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点；喷以三氯化铝试液，再置紫外光灯（,365nm,）下检视，显相同的橙红色荧光斑点。,理化性质,：,溶于乙醇、乙酸乙酯，不溶于醚、苯、三氯甲烷。,Mp:231232 UV:272nm,常见分析方法,：,HPLC;TLCS,中药名称：淫羊藿,15,中药名称,：陈皮,成分,：橙皮苷,定性鉴别方法,：,取本品粉末,0.3g,，加甲醇