培养基灭菌的目的和要求

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,培养基灭菌的目的和要求,目的：,杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。,要求：,达到要求的无菌程度,(,杂菌污染降低到被处理的每,1000,罐中只残留,1,个活菌的程度,10,-3,个,/,罐,）,；,尽量减少营养成分的破坏。,在灭菌过程中，培养基组分的破坏是由两个基本类型的反应引起的：,培养基中不同营养成分间的相互作用；,对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。,灭菌的方法,化学法,化学药品灭菌法：甲醛、苯酚等,物理法,干热灭菌法,湿热灭菌法（生物工程工业常用方法）,射线灭菌法,1.,湿热灭菌原理和影响灭菌的因素,湿热灭菌的原理：,主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡,。,致死温度与致死时间：,杀死微生物的极限温度称为,致死温度,。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为,致死时间,；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。,微生物的热阻和相对热阻：,前者是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。后者是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的,比值,。,各种微生物对湿热的相对热阻,微生物,相对热阻,营养细胞和酵母,1.0,细菌芽孢,310,6,霉菌孢子,210,病毒和噬菌体,15,某些微生物的相对热阻,灭菌方式,大肠杆菌,霉菌孢子,细菌芽孢,噬菌体或病毒,干热灭菌,1,2-10,1000,1,湿热灭菌,1,2-10,310,5,1-5,苯酚,1,1-2,110,9,30,甲醛,1,2-10,250,2,紫外线,1,5-100,2-5,5-10,湿热灭菌的优点,蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；,蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；,蒸汽有很大的潜热；,操作方便，易管理。,1.1,湿热灭菌的理论基础,将培养基中的杂菌总数,N,0,杀灭到可以接受的总数,N,（,10,-3,），需要多高的温度、多长的时间为合理。,灭菌温度和时间的确定取决于：,杂菌孢子的热灭死动力学,反应器的形式和操作方式,培养基中有效成分受热破坏的可接受范围,微生物的热死灭动力学方程：对数残留定律,微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：,N-,任一时刻的活细菌浓度，个,/L,；,t-,时间，,min,；,K-,比热死速率常数，,min,-1,，越小越耐热,细菌孢子的热死灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为,非对数的死亡动力学,。但当温度超过,120,C,时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也,接近对数死亡动力学,即符合,一级反应规律,。,取边界条件,t,0,=0,，,N=N,0,，对上式积分得,或,为理论灭菌时间的对数残留规律公式,。,问题：能不能做到绝对无菌？,温度对,K,的影响,微生物的热死灭动力学接近一级反应动力学，它的比热死灭速率常数,K,与灭菌温度,T,的关系可用阿累尼乌斯方程表征,A-,频率因子，,min,-1,E-,活化能，,J/mol,R-,通用气体常数，,J/,（,mol.k,）,活化能,E,的大小对,K,值有重大影响。其它条件相同时，,E,越高，,K,越低，热死速率越慢。,E/R,是微生物受热死亡时对温度敏感性的度量，值越大，表明微生物死亡速率随温度的变化越敏感，在灭菌中,E/R,是很重要的常数。,不同菌的孢子的热死灭反应,E,可能各不相同。,对（,4,）两边取对数，得,微生物死亡速度常数,K,与温度的关系,K,是,E,和,T,的函数，,K,的对,T,的变化率与有关，对（,5,）两边对,T,的导数，得,由该式可得出结论：,反应的,E,越高，,lnK,对,T,的变化率越大，即,T,的变化对,K,的影响越大,试验表明，细菌孢子热死灭反应的,E,很高，而某些有效成分热破坏反应的,E,较低。,将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有效成分的,E,很低，温度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少,物质,E,（,J/mol,）,维生素,B,12,96232,维生素,B,1,盐酸盐,92048,嗜热脂肪芽孢杆菌孢子,283257,肉毒梭菌孢子,343088,枯草杆菌孢子,317984,孢子热死灭和营养成分破坏活化能,E,BS,=67000,4.,184,（,J/mol,）,E,VB,=22000,4.,184,（,J/mol,）,将灭菌温度从,105,C,提高到,127,C,K,VB,从,0.02,（,min,-1,）提高到,0.06,（,min,-1,）,K,BS,从,0.12,（,min,-1,）提高到,40.0,（,min,-1,）,嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和,维生素,B,1,的,lnK-1/T,图,绝对温度倒数，,1/T,（,K,）,10,-3,2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8,嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为,N/N,0,=10,-16,时，灭菌温度对维生素,B,1,破坏的影响,灭菌温度（,C,）,达到灭菌程度的时间（,min,）,维生素,B,1,的损失（,%,）,100,843,99.99,110,75,89,120,7.6,27,130,0.851,10,140,0.107,3,150,0.015,1,1.2,影响灭菌的因素,培养基成分,培养基的物理状态,培养基中氢离子浓度,培养基中微生物数量,微生物细胞含水量,微生物细胞菌龄,微生物的耐热性,空气排出情况,搅拌,泡沫,1,、培养基成分,培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越高，微生物的热死亡速率越慢,在热死温度下，脂肪、糖分和蛋白质等有机物质在微生物细胞外面形成一层薄膜，它能有效保护微生物细胞抵抗不良环境，因此需较高的灭菌温度。,另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。,2,、培养基的物理状态,固体培养基的灭菌时间比液体培养基的灭菌时间长。其原因是液体培养基灭菌时，热的传递有对流和传导，固体培养基只有传导。对于含有少量大颗粒及粗纤维的培养基的灭菌，需提高灭菌温度，且在不影响培养基质量的条件下，采用粗过滤方法预先处理，以防培养基结块而造成灭菌的不彻底。,培养基的,pH,与灭菌时间的关系见表。,3,、,pH,培养基的,pH,越低，灭菌所需时间越短。,4,、培养基的微生物数量：,微生物数量越多，所需灭菌时间越长。,5,、微生物细胞含水量,微生物细胞含水量越多，蛋白质的凝固温度越低，越容易受热凝固而丧失生命活力。,6,、微生物细胞菌龄,老龄细胞对不良环境的抵抗力比幼龄细胞强，后者易被杀死。,7,、微生物的耐热性,细菌的营养体、酵母、霉菌的菌丝体对热较为敏感，放线菌、酵母、霉菌孢子比营养细胞的抗热性强，细菌芽孢的抗热性最强。,8,、空气排出情况,蒸汽灭菌过程中，温度的控制是通过控制罐内的,蒸汽压力,来实现。压力表显示的压力应与罐内蒸汽压力相对应，即压力表的压力所对应的温度应是罐内的实际温度。如果罐内空气排除不完全，压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽压力，,还包括了空气分压,，因此，此时罐内的实际温度就低于压力表显示压力所对应的温度，以致造成灭菌温度不够而灭菌不彻底。,9,、搅拌,：,有助于传质和传热。,10,、泡沫,泡沫中的空气形成隔层，使热量难以传递，不易达到微生物的致死温度，导致灭菌不彻底。泡沫的形成主要是由于进汽排汽不均衡，如果在灭菌过程突然减少进汽或加大排汽，则会出现大量泡沫，对易发泡沫的培养基应加消泡剂以减少泡沫量。,2.,连续灭菌流程,连续灭菌优点：,（,1,）提高产量；,（,2,）产品质量较易控制；,（,3,）蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便；,（,4,）适宜采用自动控制；,（,5,）降低劳动强度。,实际操作：,高温灭菌时间约为,1530,s,，,然后根据发酵类型不同在维持罐维持,825,min,。,2,、连续灭菌流程及设备,即在培养基输送至发酵罐的同时进行加热、保温和冷却而进行的灭菌。,（,1,）连消塔-喷淋冷却连续灭菌流程,（,1,）,配料预热罐,，将配好的料液预热到,60,70,，以避免灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；,（,2,）,连消塔,，是使高温蒸汽与料液迅速接触混合，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（,126,132,）；,（,3,）,维持罐,，维持料液温度，延长灭菌时间,（,4,）,冷却管,，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到,40,50,后，输送到预先已经灭菌过的罐内。,培养液连续灭菌流程,（,2,）喷射加热,-,真空冷却流程,喷射加热器以较高速度自喷嘴喷出，借高速流体的抽吸作用与蒸汽混合,管道维持器：维持灭菌时间,真空闪急蒸发室：由膨胀阀进入，因真空作用使水分急骤蒸发而冷却到,7080,左右，再进入发酵罐冷却到接种温度。,优点：加热和冷却在瞬间完成，营养成分破坏最少，可以采用高温灭菌，把温度升高到,140,而不致引起培养基营养成分的严重破坏。设计得合适的管道维持器能保证物料先进先出，避免过热。,缺点：受压力影响，出料泵,（,2,）喷射加热,-,真空冷却流程,（,3,）板式换热器灭菌流程,采用薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，培养液在设备中同时完成预热、灭菌及冷却过程，蒸汽加热段使培养液的温度升高，经维持段保温一段时间，然后在薄板换热器的另一段冷却，从而使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。,优点：灭菌的温度较高，灭菌时间较短，培养基的营养成分受破坏的程度较低，从而保证了培养基的质量；设备的利用率高；,缺点：过程所需的设备较多，操作较为麻烦，染菌机会也相应较多,