第2节基因工程的基本操作程序课件

第2节基因工程的基本操作程序,第2节基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四个,步,骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体,一、目的基因的获取,1,目的基因主要是,编码蛋白质的基因,：,如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相,关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、,与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的,基因、具调控作用的因子等。,2,获取目的基因的常用方法：,1、,从基因文库中获取,2、,利用PCR技术扩增,3、,人工合成,一、目的基因的获取1目的基因主要是编码蛋白质的基因：2获取目,1.从基因文库中获取目的基因,1.基因文库的概念:,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的,群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。,2.基因文库的种类:,基因组文库：,含有一种生物的,全部,基因,部分基因文库：,只包含了一种生物的,部分,基因，,如：cDNA文库,3.基因文库的目的：,为了在,不知,目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,1.从基因文库中获取目的基因1.基因文库的概念:将含有某,基因组DNA文库与cDNA文库,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,限制酶,与运载体连接导入,基因组文库,cDNA,反转录,受体菌群体,与运载体连接导入,cDNA文库,某种生物某个时期的mRNA,基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA 许多DN,基因的结构,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,启动子,原核,真核,基因的结构非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质,连续不间断,编码区,非编码区,调控遗传信息表达,上,游的RNA聚合酶结合位点:,基因结构,原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有RNA聚合 酶结合位点(启动子)。,与RNA聚合酶结合位点,基因结构,真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子 外显子 启动,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_的,编码区是间隔的、_的,相同点,都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,思考,原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区,基因文库的构建方法,基因组文库的构建,提取某种生物的,全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,基因文库的构建方法 基因组文库的构建提取某种生物的全部DN,cDNA文库的构建-逆转录法：,提取某种生物的某器官或,特定,发育时期的,mRNA,单链DNA,双链DNA片段,重组载体,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌中储存,cDNA文库的构建-逆转录法：提取某种生物的某,思考？,真核生物的基因用,逆转录法,得到的,cDNA与原基因相同吗？,思考？真核生物的基因用逆转录法得到的,真核细胞的cDNA的获取,编码区,非编码区,非编码区,DNA聚合酶,剪接有关的酶,RNA聚合酶,mRNA前体,mRNA,单链DNA,双链DNA,逆转录酶,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含,非编码序列,。即不含,非编码区,和,内含子,真核细胞的cDNA的获取编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,文库类型,cDNA文库,基因组文库,文库大小,基因中,启动子,（具有启动作用的DNA片段）,基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）,基因多少,物种间的基因交流,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,基因组DNA文库与cDNA文库的比较 文库类型,2.利用PCR技术扩增目的基因,1,概念：,PCR全称为_，是一项,在生物_复制_的核酸合成技术。,2,原理：,DNA复制,原料：,模板DNA；,DNA引物,；四种脱氧核苷酸；,热稳定DNA聚合酶,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,3,前提：,已知目的基因的一段核苷酸序列,2.利用PCR技术扩增目的基因1概念：2原理：DNA复制多聚,第2节基因工程的基本操作程序课件,PCR技术的操作过程,a、DNA变性,（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火,（,复性,55-65）：系统温度降低，,引物,与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸,（70-75）：在,Taq酶,的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.,重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,PCR技术的操作过程a、DNA变性（90-95）：双链D,PCR技术的操作过程,PCR技术的操作过程,PCR技术的操作过程,PCR反应体系中目的基因成,指数(2,n,),形式扩增,PCR技术的操作过程PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形,PCR,技术扩增与DNA复制的比较,DNA复制,PCR技术,场所,原理,条件,解旋方式,酶,特点,结果,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、,ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、,引物,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、,边解旋边复制,半保留复制、,全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等,PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理,3.人工合成法,在,基因较小，核苷酸序列已知,的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,思考：,化学法合成的目的基因含,内含子、启动子和终止子,吗？,3.人工合成法 在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利,人工合成法,（,真核生物,）,反转录法,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,推测,推测,单链DNA,合成,人工合成法（真核生物）反转录法目的基因的信使RNA目的基因化,课堂小结,目的基因的获取,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,种类,基因组文库：,含有一种生物的,全部,基因,部分基因文库：,只包含了一种生物的,部分,基因，,如：cDNA文库,课堂小结目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术,二、基因表达载体的构建,基因工程的核心,1,目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可,以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达,和发挥作用。,2,基因,表达载体,的组成：,复制原点+目的基因+启动子,+终止子+标记基因,二、基因表达载体的构建 基因工程的核心1目的：2基因表达,表达载体,启动子：,位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是,RNA聚合酶识别和结合的部位,，有了它才能,驱动基因转录出mRNA，,最终获得蛋白质,终止子：,位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，,能终止mRNA的转录,标记基因,的作用是,为了,鉴别,受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,表达载体启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是R,基因表达载体的构建过程,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口,获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口,两个黏性末端,基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口DNA,注意：,载体,与,表达载体,的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了,目的基因、启动子、终止子,三部分结构,用到的工具酶：,既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键,启动子、终止子,对于目的基因表达必不可少,目的基因不能单独进入受体细胞，,必需以表达载体的方式携带进去。,注意：载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部,三、将目的基因导入受体细胞,1,转化,：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞,内维持稳定和表达的过程。,2,常用的受体细胞：,大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌,和动植物细胞等。,3,目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,三、将目的基因导入受体细胞1转化：2常用的受体细胞：3目的,1、目的基因导入植物细胞的方法,（1）农杆菌转化法,农杆菌特点：易感染,双子叶植物,和,裸子植 物,，对大多数单子叶植物没有感染能力。,原理：,Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上,。,1、目的基因导入植物细胞的方法（1）农杆菌转化法 农杆,三、目的基因导入受体细胞,构建基因表达载体,转入,农杆菌,植物细胞,导入,稳定维持和表达,过程：,三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导,1、目的基因导入植物细胞的方法,（2）基因枪法：,目的基因导入单子叶植物细胞,操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法,。,钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。,适用：,单子叶植物,1、目的基因导入植物细胞的方法（2）基因枪法：目的基因导入单,1、目的基因导入植物细胞的方法,（3）花粉管通道法：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,特点:十分简便经济。,例：转基因抗虫棉,1、目的基因导入植物细胞的方法（3）花粉管通道法：将目的基因,2、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序目的基因表,3、将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,常用菌：大肠杆菌,常用法：Ca,2+,处理获得感受态细胞,过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态,细胞,感受态细胞,吸收,DNA,表达载体,与感受态,细胞混合,3、将目的基因导入微生物细胞微生物作受体细胞原因：Ca2+,小结：,将目的基因导入受体细胞,生物种类,植物细胞,动物细胞,微生物细胞,常用方法,农杆菌转化法,显微注射技术,Ca,2+,处理法,受体细胞,体细胞,受精卵,原核细胞,转化过程,将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA表达,将含有目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物,Ca,2+,处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子,小结：将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细,四、目的基因的检测与鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？,1,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,2,目的