DNA的结构与功能

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,组成核酸的基本单元核苷酸,1,核酸的一级和二级结构,2,核酸的高级结构,3,4,DNA,与蛋白质的相互作用,1,一、基本单元,核苷酸,1,、核苷酸的结构：,三部分：碱基戊糖磷酸；,碱基通过,N,糖苷键与戊糖第一位碳原子（,C1,）相连；,磷酸基团通过磷酯键与戊糖第五位碳原子（,C5,）相连。,2,嘌呤,嘧啶,2,、两种核糖：,3,、五种碱基：,3,二、核酸的一级结构和二级结构,1,、核苷酸的共价结构，也即核酸的一级结构，是指核酸的核苷酸序列。其结构特点是：,3,5,-,磷酸二酯键；,5,端磷酸基团尾，,3,端羟基尾；,无分支；,2,、核酸可被酸、碱和酶水解。,核酸水解产生各种寡核苷酸、核苷酸、核苷和碱基。,4,2,、核酸的二级结构，是由,碱基对氢键,维系的结构。,Watson,和,Crick,于,1953,年提出,DNA,双螺旋结构模型,反向平行,缠绕，均为,右手,螺旋；,嘌呤与嘧啶位于,内侧,。磷酸与核糖位于,外侧,，通过,3,，,5,磷酸二酯键，形成,DNA,的,骨架,；,一条,大沟,和一条,小沟,；,双螺旋直径为,2nm,，相邻碱基对距离为,0.34nm,，每一周有,10,个核苷酸，螺距为,3.4nm,；,碱基对氢键维系，,A,T,，,G C,。,（一）,DNA,的,waston,Crick,结构模型特征：,5,（二）碱基对配对特征：,G C,比,A,T,更稳定。,6,A,型,B,型,Z,型,外形 粗短 适中 细长,螺旋方向 右手 右手 左手,轴与碱基对的倾角 不穿过 穿过 穿过,碱基对 碱基对 碱基对,大沟 很狭，很宽，平坦,很深 较深,小沟 很宽、狭、深 较狭、,浅 很深,（三）,DNA,的三种二级结构（多态性）：,B-DNA,是,DNA,的最基本构象。,7,DNA,的三级结构是指,DNA,双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的构象。,包括线形双链中的纽结（,kinked,）、超螺旋（,supercoiled,superhelix,）、多重螺旋、分子内局部单链环和环状,DNA,中的超螺旋及连环等。,超螺旋,结构是,DNA,三级结构中最常见的一种结构。,环状,DNA,分子，线形双螺旋分子两端连接起来或因与蛋白质结合而固定时，进一步扭曲都可形成超螺旋。,双螺旋,DNA,处于拧紧状态时所形成的超螺旋称作正超螺旋（左手超螺旋）（,positive supercoil,），处于拧松状态则形成负超螺旋（右手超螺旋）（,negative supercoil,）。天然,DNA,分子都处于负超螺旋。,三、核酸的三级结构,8,9,Nucleosome,Prokaryotic chromosome structure,10,DNA,和蛋白质的相互作用,11,DNA,与蛋白质相互作用是基因表达调控的分子基础。,生物体在发育过程中或应答外界环境刺激时，蛋白质（如转录因子）与,DNA（,调控元件）相互作用起着调控基因开关的作用。,这些蛋白质直接或者与其他蛋白质结合后间接识别靶基因,DNA,的特定位点，并且特异地同靶基因的,DNA,特定位点结合（一般8,12bp,核心序列,），,参与基因组,DNA,的复制和转录调控。这种识别是通过蛋白质和不同的,DNA,结合来实现的。,12,（,一）,DNA,与蛋白质的相互作用的主要类型,（1）螺旋,转角,螺旋,（2）亮氨酸拉链,（3）锌指蛋白区域,（4）螺旋-环-螺旋,（5）碱性,-,螺旋,（6）-,折叠,（7）同源异形盒顺序,（8）同源域蛋白,13,（1）螺旋,转角,螺旋,螺旋,转角,螺旋出现在一些细菌调节蛋白上，它由两条通过一条氨基酸链连接成的,-,螺旋组成，从而形成了转角。每一条,-,螺旋包含有折叠成右手螺旋的线性氨基酸序列。,羧基末端的,-,螺旋适合与,DNA,大沟配合,。,含两个,-,螺旋由一段大弯曲连接(1520个氨基酸残基)，其一称识别螺旋正好与,DNA,特异顺序上的大沟或小沟吻合可结合到,DNA,的沟槽中，而另一螺旋与部分,DNA,序列互作起支持和稳定识别螺旋的作用。调节蛋白中通常有两个,Helix-turn-helix,形成二聚体（,dimers）,正好插入,DNA,上相邻的两个大小槽内，多数是大槽。,14,15,（2）亮氨酸拉链,亮氨酸拉链出现在许多真核基因中。它存在于蛋白质中，位于,DNA,结合域附近。,1个亮氨酸重复形成的,-,螺旋与另一个蛋白质的,-,螺旋可形成一个盘绕或是拉链结构。这两条链通过亮氨酸间的疏水作用连在一起。,在它们结合形成的,Y,型结构中，每一个臂（一个,-,螺旋）可以与,DNA,大沟上某个特定的主要部分成键。,由两条相同或不同的肽段上两个,螺旋（,helix）,组成的卷曲螺旋（,coil），,由一系列间隔7个氨基酸的亮氨酸残基靠疏水作用形成，端部的两个,螺旋由,leucine zipper,将其插入,DNA,的两个大槽内。含,leucine zipper,调节蛋白在正常细胞中行使重要功能，其也在一些非调节蛋白中存在。,Leucine zipper,可将含,helix-turn-helix,和,zinc finger,的调节蛋白连接在一起。,16,17,（3）锌指蛋白区域,锌指蛋白区域出现在许多,DNA,结合蛋白中。它,包含一个与锌原子结合的,-,螺旋,。在蛋白质中，这种结构可以多次重复，例如，一条,-,螺旋和一个,折叠片可以通过锌原子连接。在许多时候，这种结构以,-,螺旋和,DNA,大沟相互作用的方式存在，形成一个很强的特殊的相互作用。另外一种锌指结构是有两条,-,螺旋通过与,DNA,大沟相互作用形成的二聚物的形式，与螺旋-转角-螺旋结构非常类似。,18,由约,30个氨基酸组成，含两个胱氨酸和两个组氨酸或有时是4个胱氨酸与锌原子构成四部分复合物将氨基酸链拉成指头状的环（,loop），,可伸展到,DNA,大槽上的碱基边缘产生相互作用。,含锌指结构的调节蛋白通常有2-10个锌指,，与相邻,DNA,区段相互作用。大约有200多种调节蛋白含锌指基序是最普遍的,DNA,结合结构，锌亦可稳定其它,DNA,结合蛋白。,19,锌指结构简图,20,21,（4）螺旋-环-螺旋（,HLH,）,DNA,结合蛋白的共同特性是具有一些与,DNA,结合的螺旋区，并能形成二聚体。螺旋,环,螺旋(,helix-loop-helix，HLH),蛋白质具备上述两种特性，并都有一个共同的基序。,基序由4050个氨基酸组成，含有2个两亲的(,amphipathic，,既有极性基也有非极性基)螺旋，,由2个长度不等的连接区(环)相连。通过两条螺旋对应位置上的疏水性氨基酸残基之间的相互作用，可以生成同源二聚体或异源二聚体。每个螺旋区长1516个氨基酸，其中有几个氨基酸残基是保守的。两个螺旋区之间的环使两个螺旋区可以彼此独立地相互作用。,22,23,（5）碱性,-,螺旋,两个两性,-,螺旋(每个约12,-,15氨基酸)，,-,螺旋一些部位存在密集的,碱性氨基酸,，一侧是疏水氨基酸，利于形成二聚体。,（6）-,折叠,反平行,-,折叠与,DNA,大沟,结合，亦多数是二聚体,。,24,（7）同源异形盒顺序,同源异形基因均有一,同源异形盒顺序,（,homeobox sequence），,长约180核苷酸编码60个氨基酸，该区段折叠成同源异形域（,homeodomain）,可识别并结合同源异形基因控制的所有基因的5,侧翼区。,同源异形域含四个,螺旋,，第2、3螺旋形成,helix-turn-helix,基序结合到,DNA,上8个碱基组成的八聚体顺序（,octamer sequence）,由第3螺旋插入,DNA,上。,25,（8）同源域蛋白,26,蛋白质与,DNA,结合的特性,普遍性结合,蛋白质与,DNA,的主链,骨架,接触，,多数碱性或中性侧链与磷酸二酯键的氧接触,，短的极性侧链和,-NH,与,DNA,骨架接触提供更多的立体接触特异性。,特异性结合,蛋白质识别,DNA,的特定序列，与,碱基,直接接触：直接氢键、水分子介导氢键、疏水接触，多数发生在,大沟,内,(,碱基顺序表面,),。,1)DNA,碱基顺序出现二度对称性结合蛋白质二聚体；,2),蛋白质,-DNA,结合发生在,DNA,分子的一侧；,3),结合蛋白质由识别螺旋结合,DNA,特定部位；,4),蛋白质,-DNA,分子发生构象变化达到相互作用；,5),蛋白质碱性氨基酸残基与,DNA,磷酸基形成离子键。,27,DNA,和蛋白质相互作用的研究方法,酵母单杂交体系,酵母单杂交体系是一种识别稳定结合于,DNA,上的蛋白质的强有力的研究方法。,特点：可在酵母细胞内研究真核细胞,DNA,和蛋白质之间的相互作用,并通过筛选,DNA,文库直接得到与靶序列相互作用的蛋白质基因序列。,28,2.DNA-,蛋白质印记杂交,主要用于调控蛋白与,DNA,调控元件相互作用的研究,是根据位点特异性,DNA,结合蛋白借助于氢键、离子键和疏水键与同位素标记的特异,DNA,序列探针结合,通过放射自显影体系对,DNA,结合蛋白进行定性、定量及对基因组,DNA,结合序列进行定位分析的一种方法。,特点：,可以鉴定有无序列特异性,DNA,结合蛋白；,检测蛋白质纯化过程中的,DNA,结合活性，及结合序列的定位；,可以确定,DNA,结合蛋白的分子量。,29,3.,凝胶阻滞电泳,原理：,在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的,DNA,朝正电极移动的距离是同其分子量的对数成反比，如果,DNA,分子结合上一种蛋白质，那么由于分子量加大在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正电极移动的距离也就相应缩短了。所以当特定的,DNA,片段同细胞提取物混合之后，若其在凝胶电泳中的移动距离变小了，这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋白质分子发生了结合作用。,30,4.DNase1,足迹法,首先将待测双链,DNA,片段中一条单链的一端选择性地进行末端标记,然后加入恰当浓度的,DNase1,使在,DNA,链上随机形成缺口,经变性后进行电泳分离,放射自显影,即可形成以相差一个核苷酸为梯度的,DNA,条带。,但当,DNA,片段与相应的序列特异性,DNA,结合蛋白结合后,DNA,结合蛋白可保护相应的,DNA,序列不受,DNase1,的攻击,因而在放射自显影图谱上,DNA,梯度条带在相应于,DNA,结合蛋白的结合区中断,从而形成一空白区,恰似蛋白质在,DNA,上留下的足迹,因此形象地称作足迹法。如果同时进行,DNA,化学测序,即,可判断出结合区的精确顺序,。,31,5.DNA,与蛋白质复合体的电镜观察,借助于电子显微镜,可以观察到,DNA,复制,重组和转录等过程中的,DNA,一蛋白质复合体的活体状态。,利用电子显微镜进行,DNA,一蛋白质复合体的观察包括以下三个步骤：,复合体的形成；,未被,DNA,结合的蛋白质的去除；,电子显微镜供试材料的制备。,32,