修美乐研究报告

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2016/8/29,#,全人源单抗,-,修美乐,Contents:,研发背景,分子基础以及构建,安全及有效性评价,前景展望,一、研发背景,巴,斯夫旗下诺尔药业,英国剑桥抗体技术公,司,CAT,噬菌,体,展示,技术,筛选得到某一特定抗原表位的,TNF,抗体,人源化加工处理,得到第一个完全人源化抗,TNF-,单抗药物,D2E7,期临床试验证明有疗效,继续研发、建立营销渠道需要很大投入,巴斯夫回归化学主业,剥离诺尔药业,2000,年，雅培以,69,亿美元收购,诺尔药业及其所有上市和在研产品,。,1993,年,一、研发背景,2003,年,1,月首次在美国上市，美国食品药品管理局（,FDA,）批准,用,于治疗中到重度类风湿关节炎,雅培耗资,10,亿美元以扩展该药的新适应症：,银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、,斑块型银屑病、多关节型幼年特发性关节炎,2012.10,，美国,FDA,批准了该药的第七个适应症,:,溃疡性结肠炎。这使得修美乐将在慢性病领域发挥作用，并影响美国的,62,万患者。修美乐在溃疡性结肠炎这一领域的使用，为其增加额外的,5,亿甚至更多的销售额,。,修美乐可以预见适应症还将继续拓宽，,2015,年已经分别向,FDA,和欧洲药管局（,EMA,）提交了该药物用于化脓性汗腺炎的新药上市申请。,一、研发背景,2012,年起，修美乐就以,94.8,亿的成绩稳坐全球药物销售排行榜榜首。,2015,年的销售额更是达到了,140.9,亿元。,新药层出不穷,，修,美乐能够荣登全球畅销药之首的,主要原因是：,产品过硬、适应症广、受众群大,，能解决临床上的迫切需求,。,2013,年，雅培宣布进行拆分，修美乐被划归,为专注于生物制药研发的新公司艾伯维旗下,全人源抗体制备的四种途径,:,一,.,从采集的病人血样中构建,Fab,或者,ScFv,文库，并通过噬菌体展示筛选抗体库，来产生人源,MAb,。,二,.,用含有人免疫球蛋白基因位点的转基因小鼠进行免疫，可以产生人抗体的免疫应答，这样通过传统的杂交瘤技术可以来生产人源,MAb,。,二,.,分子基础以及构建,全人源抗体制备的四种途,径,:,三,.,通过分离培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，然后用抗原进行免疫刺激，产生免疫应答，然后再和人类骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，经筛选得到人源单克隆抗体，并立即进行分子克隆抗体基因，必要时通过亲和力成熟技术提高其与药靶抗原的亲和力，再克隆进入可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体，这种抗体完全是在人细胞环境中生成的,。,四,.,通过分离和低密度,(,约,500B,细胞每,96,孔,),培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，对培养上清进行抗原特异性筛选，对阳性孔,B,细胞进行分子克隆获得人抗体基因，再使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体。,二,.,分子基础以及构建,阿达木单抗是重组人源,IgG1,单克隆抗体,，阿,达木单抗含有人源轻链和重链可变区序列和人源,IgG1,，,链恒,定区序,列，包,括,1330,氨基酸残基，分子量大概有,148kD,。,该,抗体对,hTNF-,具有很高的亲和,性（,Kd=10,-8,M or less,）和,比较低的解离速,率（,K,off,=10,-3,/s or less),，,阻,止其与细胞表面的,TNF,受体,p55,，,p75,位点结合，能够使体内表面,TNF,表达的细胞裂解，导致,TNF,水平降低,。,能,够中和,hTNF-,的活性包括,hTNF-,诱导的细胞毒性和细胞活化作,用。,关,于,D2E7,的结合特异性，其可与各种形式的,hTNF,结合，包括可溶性,hTNF,，跨膜,hTNF,和与细胞受体连接的,hTNF,。,D2E7,不会与其它细胞因子特异性结合。,二,.,分子基础以及构建,轻链可变区序列,二,.,分子基础以及构建,D2E7,的一级结构,重链可变区序列,二,.,分子基础以及构建,重组人源抗体的,筛,选,1.,建,立人源,scFV,噬菌体抗体,库。,其是从人类淋巴细胞中分离的编码重链和轻链可变区的,mRNA,经噬菌体展示技术得到的。,2,.,为,了分离与,hTNF,具有高亲和力和低解离率的人源抗体，选择对,hTNF,具有高亲和力的鼠源抗体（,MAK 195,）用,抗原表位印记,（,epitope imprinting),的方法选择对,hTNF,具有亲和力的人源序,列。,3.,选,好了,VH,和,VL,片段之后，“,mix and match,”,实验用来筛选合适的,VH,和,VL,配对,。,4.,获,得编码合适抗体的,DNA,序列后，亚克隆于其它表达载体进行表达。,二,.,分子基础以及构建,获取编码抗体轻链和重链可变区的,DNA,片段,二,.,构建过程,经突,变后编,码,D2E7,或者,D2E7,相,近抗体的,氨基酸序列。,通过重组,DNA,技术进行下一步操作,表达载体的构建,人源序列的突变通过标准方法获取。例如,:PCR,介导的突变（即通过引物使突变的核苷酸插入）或者定点突变,抗体的表达,这,可,通,过,PCR,对人源轻链和重链的修饰和扩增获得,。,例如为了获得,D2E7,或与其相近抗体的编码重链可变区的,DNA,片段，人,VH,基因的,VH3,基因家族中某一基因（,DP-31),通过,PCR,进行扩增。为了获得轻链可变区基因片段，人,VL,基因的,VI,家族中的某一基因（,A20,）通过,PCR,进行扩增。,如何获取？,例如把可变区序列转变为完整的抗体，,Fab,或者,scFV,片段。即把轻重链可变区序列分别与其对应的恒定区结合，重链恒定,区可以是,IgG1-4,、,IgA,、,IgD,、,IgM,和,IgE,，最,好是,IgG1,和,IgG4,的恒定区。轻链恒定区可以是,和,链恒定区，最好是,链恒定区。,如何重组？,为了表达,D2E7,，,抗,体的轻链基因和重链基因可以插入到不同的载体，但最好插入到同一载体。,D2E7,或者其相关的轻链和重链基因在连接到载体之前，载体上可能已经携带抗体恒定区序列,。,另外，重组表达载体可以编码一个信号肽，从而有利于抗,体从,宿主细,胞的分泌。,除了抗体链基因，重组表达载体携带了可调控抗体链基因在宿主细胞表达的调控序列。调控序列包括启动子，增强子和其它表达控制元件,。,除了抗体链基因和调控序列，该重组表达载体还可以携带其他序列，如调控载体复制的序列和选择标记基因,。,载体构建注意事项：,对于哺乳动物的宿主细胞表达更倾向于使用病毒元件，从而有利于其在哺乳动物细胞中的高效表达。例如来自巨细胞病毒（,CMV,），猴病毒,40,（,SV40),，腺病毒，多瘤病毒等的启动子和增强子,把携带有抗体轻链和重链基因的载体转染到宿主细胞中,去：,尽,管在理论上其在真核和原核细胞中都能表达，在真核细胞尤其是哺乳动物细胞中表达是最好的方式,。,表,达重组抗体的细胞倾向于使用,CHO,细胞（包括,dhfr-CHO,细胞，含有,DHFR,选择性标记），,NSO,骨髓瘤细胞，,COS,细胞和,SP2,细胞,。,重,组表达载体转入宿主细胞后经过一段时间的表达，表达后的抗体分泌到培养基上。然后利用蛋白质纯化的方法收集抗体,。,宿,主细胞也可以用来产生不完整的抗体，如,Fab,或者,scFV,分子。研发过程试验了各种形式的抗体，重组,DNA,技术可以用来排除不能结合,hTNF,的抗体。,二,.,构建过程,对,于抗体或者其抗原结合部位的表达最倾向于使用载有编码抗体重链和轻链的基因的重组表达载体通过磷酸钙转染法转入到,dfhr-CHO,细胞中,。,重,组表达载体中，轻链和重链基因连接到,CMV,增强子和,AdMLP,（腺病毒）启动子以增强其高水平表达,。,重,组表达载体携带有,DHFR,标记基因，可用甲氨蝶呤进行选择。最后培养宿主细胞进行抗体的表达，并从培养基中收集到抗体。,二,.,总结,不良反应,常见不良反应有抗核抗体,(ANA,),转阳性,(12,%),、产生,低,滴度,的,D2E7,抗,体,(5,%),、注射部位反应,(12%),、头痛,(12%),、,高血压,(5,%),等,。,严重不良反应有严重感染、恶性肿瘤和淋巴瘤及神经,系统,反应。严重感染主要为上呼吸道感染、尿路感染和支气,管炎,等,发生率为每,年,100,人中,0.04,人。恶,性肿瘤和淋巴瘤,的标,准化发生率,(SIR)(,实际观察发病人数,/,预,期发病人数,),分别为,1.0,和,5.4,。,神,经系统反应主要为脱髓鞘作,用,出,现,皮肤,感觉异常。,三,.,安全及有效性评价,有效性,271,例,患者参加的一项随,机,、,双,盲、安慰剂对照的试,验,为期,24,周,患者被随机分,为,4,组,分,别接,受,D2E7 20,40,80mg,及,安慰剂皮下注射,每,2,周,1,次,同,时服,用,MTX,（甲氨蝶呤）,剂,量不,变。第,24,周,时采,用,ACR,制,定,的,20%,50%,70,%,改善,标准,(ACR20,ACR50,ACR70,),评价疗效。,三,.,安全及有效性评价,三,.,安全及有效性评价,结果显示,在治疗,第,24,周,D2E7,加,MTX,组,患,者,ACR20,改善,率分别为,47.8%,、,67.2,%,和,65.8%,显,著高于安,慰剂加,MTX,组,;,D2E7,治,疗,组,ACR50,改,善率分别,为,31.9%,55.2,%,和,42.5%,亦,显,著高,于安,慰剂,组,;,D2E7,的,40,80mg,治疗组,ACR70,改善率,为,26.9,%,和,19.2%,也,显著高于安慰剂对,照组,。,三,.,安全及有效性评价,目,前，我国与国外的技术还有比较大的差距。全人源抗体的构建与动物细胞大规模培养技术是限制我国单抗药物的瓶颈，应加大力度攻克技术难关。,我,国的生物制药公,司应,尽快加紧对修美,乐,等,仿,制药物的研发,，,这,不,仅能给自己的公司带来一大笔利润，更能造福我国的类风湿关节炎等自身免疫性疾病患者。,四,.,前景展望,1.Jochen G,Salfeld,North Grafton et.al.Human antibody that bind human TNF,.,United States Patent NO.6090382.1996.,2.,谢玉婷,汪年松,.,阿达木单抗在类风湿关节炎治疗中的应用,J.,世界临床药物,2012,33(2):65-69.,3.,丁俊杰,李中东,王宏图,.,治疗类风湿关节炎新药,全人源,-,肿瘤坏死因子单克隆抗体,J.,中国药学杂志,2005,40(2):157-158.,4.,冯晓,张洁涵,李福军,等,.,抗,TNF,的全人源单克隆抗体及其应用,:,中国,CN104892760A.2014.,5.Weinblatt ME,Keystone EC,Furst DE,et.al.Adalimumab,a fully human anti-tumor necrosis factor alpha monoclonal antibody,for the treatment of rheumatoid arthritis in patients taking concomitant methotrexate:the ARMADA trial.Arthritis Rheum 2003,48:35-45.,参考文献,Thanks for,l,istening,