高效液相色谱HPLC简介

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,高效液相色谱（,HPLC,）简介,案丈脾消绘磊改踪锤这靖釉梆刊适汕测吐贤抬拔扔浊剐田睦罕岁灸冷奢伙高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,目 录,1,液相色谱分析法的发展,2,高效液相色谱的特点,3,高效液相色谱仪简介,4,液相色谱法介绍,5,分析方法的选择,6,实际分析操作过程,鄙的澡苔某扰马瘪茁好厉叁兆牙妓浪壹溅嫩躲僻擂测该踪意蚊潍携量彰围高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,1,、液相色谱分析法的发展,20,世纪初：,俄国植物学家茨维特提出,经典液相色谱法,。经典液相色谱法包括柱色谱、薄层色谱、纸色谱。,20,世纪,60,年代末：,随着,色谱理论,的发展、,高效细微固定相,的开发、,高压恒流泵,及,高灵敏度检测器,的应用，高效液相色谱法得到了突破性的发展。,鲍挎肛蹦猫征蓝答久尔脓党汤色窑悼朽桐蛙玲守詹结厄袱叛碑晰植绑著乃高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,2.1,HPLC,的特点,（一）,项 目,高效液相色谱法,经典液相色谱法,色谱柱：柱长,/cm,柱内径,/mm,10,25,2,10,10,200,10,50,固定相粒径,/m,5,50,75,600,色谱柱柱效,（理论塔板数）,2,10,3,5,10,4,2,50,柱压降,/MPa,5,15,0.001,0.3,进样量,/g,10,-6,10,-2,0.1,10,分析时间,/h,0.05,1.0,1,20,2,HPLC,的特点,周翠芒翠瘴基蝶窑堕灶泌贿臻嫡日湾参逛鞘静疹窃鸯小近滩便至绞箱佑趁高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,.2,HPLC,的特点（二）,项 目,高效液相色谱法,气相色谱法,进样方式,样品制成溶液,样品需气化或裂解,流动相,溶液,惰性气体,分离原理,吸附、分配、筛析、亲和等,吸附和分配,检测器,UVD,、,PDAD,、,RID,等,TCD,、,FID,、,ECD,等,应用范围,低、中、高沸点有机化合物,离子型无机化合物,热不稳定化合物,生物活性分子,低沸点有机化合物,永久性气体,逮菩邵衍膨梭闪谱若溜约刁包啄猖谅烽笼忆药罪星秒耽酗存柑皂裔眠人怯高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,3,、液相色谱仪简介,贮液罐,A,高压输液泵,A,阻尼器,A,贮液罐,B,高压输液泵,B,阻尼器,B,初步混合器 压力传感器 混合器,进样器 色谱柱 检测器 谱图输出,览蓑宰条奥绚缅慷妖堑鱼跺亿床勾掠己桩澈扯创恬闰浆还衍颐射符谆乱薯高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,3.1,高效液相色谱仪构造,屈纵姆眩凳闽请哎跌卢段倦果予良珍寡丝赎帚彻忻洒价丧复悔憨炔抡涧邱高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,3.2,高压输液泵简介,高压输液泵的一般要求：,泵体材料耐酸、耐碱、耐化学腐蚀；,耐压,40,50MPa,，能连续工作；,输出流量稳定，重复性佳；,输出流量范围宽，对填充柱：,0.1,100mL,min,。,注射型泵,-,输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。,恒流泵,往复型泵,-,造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。,恒压泵,-,压力恒定，但流量不恒定；,街尉螟比遇批狰滁域距索拱帘嚣黎娠狗导认壹荆乘描婆喘申蝇倘截铱丢艾高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,3.3,阻尼器介绍,阻尼器,-,消除、减轻往复式柱塞泵输出的压力脉动。,汇蹄想九爪睫殃蒜扰鸦答斋陪帧稍蹈秉蛾别蔷胃项夕窃园髓轰兹钨珐崖嗡高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,3.4.1,检测器简介（一）,紫外吸收,检测器（,UVD,）,原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测,透光率,的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型。,特点：选择性检测器、对流量和温度敏感性低、灵敏度较高（,10,-9,g,）。,折光指数,检测器（,RID,）,原理：监测参比池和测量池中溶液的,折射率,之差来测量试样浓度的检测器。,特点：通用性检测器，温变化要保持在,0.001,、灵敏度低（,10,-6,g,）。,泳痛透抵恿赤谆础箕狱匡束珊汁弘呜砌纸但郡垂脱畸腕隐疤舍昆伸峭湖华高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,3.4.2,检测器简介（二）,电导,检测器（,ECD,）,原理：监测溶液的,电导率变化,的检测器。,特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度低（,10,-3,g,）。适用于离子型化合物。,荧光,检测器（,FLD,）,原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。,特点：选择性检测器、灵敏度高（,10,-12,g,）、对流量和温度敏感性低。,椭肄铜洛夸愚扮鞋脂罐言堂聂凯赊慌偷匣毡怀狞辖薪截揉伍际拇倚叼慰冲高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,3.4.3,检测器简介（三）,蒸发光散射,检测器（,ELSD,）,原理：通过检测,光散射,程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。,特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高，是通用型检测器。,让掐矣温腆噪蜡唯翌拴主酚谩伶扔彝盛骸眷枷秘履幂哀赂跌疫赤筏抿常桶高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,4,、色谱分析法简介,液固色谱,-,以,固体吸附剂,为固定相，依靠吸附脱附平衡实现分离，常用的固定相有碳酸钙、硅胶、三氧化二铝、氧化镁、活性炭等。,特点：有时会发生不可逆吸附，应用受到限制。,液液色谱,-,以吸附载带在惰性固相载体上的,极性或非极性固定液,为固定相，依靠溶解解吸平衡实现分离。,特点：固定液可选择余地大，重现性、分离效果好。,4.1.1,色谱分析法介绍（一）,符匡窝拖曙产站曹绚敢童菌恰翘度魏寝莆度释缝分协忿肾革惹证鞘鸿蘸椒高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,4.1.2,色谱法简介（二）,体积排阻,色谱法,-,以,多孔性凝胶,为固定相，借助多孔性凝胶孔径的大小，使样品中的大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，而首先被洗脱出来。被分析样品可按分子的相对大小分别先后流出。,特点：洗脱时间短，但不适于分离组成复杂的混合物。,适用范围：分子量差别较大的样品。,离子对色谱,法,-,分析离子化的,强极性,化合物。,亲和,色谱法等等,料噪沼逢眩凋推频齐凝友臣特郎鄙帘应泳坑扫谬栈晦峦主畸歇仰累沉佃颓高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,4.1.3,色谱法简介（三）,键合相,色谱法简介,键合相色谱,-,是由液液色谱发展起来的，在高效液相色谱法中占有极其重要的地位。将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，生成化学键合固定相，解决,固定液的流失,问题,是目前用的最多的一种,色谱分析法。,根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，分为正相键合相色谱法与反相键合相色谱法。,正相键合相色谱,-,固定相极性强；,反相键合相色谱,-,固定相极性弱。,碴竞妥萌剧进诅凳续懈给什逃鱼饿坯蛮模削豫陵买并察碱铡哩艾当瞥涕核高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,.2.1,色谱柱简介（一）,正相柱,-,固定相通常为硅胶以及其他具有,极性官能团,胺基团，如（,NH,2,）和氰基团（,CN,）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（,SiOH,）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。,反相柱,-,固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有,极性相对较弱官能团,的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有：,C18,（,ODS,）、,C8,（,MOS,）、,C4,（,Butyl,）、,C6H5,（,Phenyl,）等。,乍神弱砷涎尿搏纪辞程衙准皱八市们每渝伶闸镊骤番巨汇秩杭日尘吁映醇高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,4.2.2,色谱柱简介（二）,聚合物填料柱,-,通常为聚苯乙烯,二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等,.,优点：,PH,值为,1,14,均可使用；具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。,缺点：色谱柱柱效较低。,其它无机填料柱,-,如石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。由于在,HPLC,流动相中不会被溶解，这类柱可在任何,PH,与温度下使用，石墨化碳可用于分离某些几何异构体。氧化铝也可以用于,HPLC,。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在,PH,高达,12,的流动相中使用。,干陇猾术伴焉码瘁猫坷钟屡耘在句巨泞瘦脾懦钉纵贺世搀疼诀眠支吊弗平高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,4.2.3,色谱柱简介（三）,手性柱,-,将手性聚合物共价键和到硅胶上，实现外消旋物的广泛分离。如下图：,特点：具有专一性、通用性不广。,价格较贵。,辣允堤堤糯而烹稻讨仆揍毁毗宋榆撰冕酣说肛透嘲握窗枕份猫尖咏原陷趋高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,5,、分析方法的建立,5.1,色谱柱的选择：,疏水性的样品,反相键合色谱；,亲水性的样品,正相键合色谱；,生物大分子,体积排阻,色谱；,无机离子化合物,离子对色谱；,高分子聚合,凝胶色谱；,同系物的分离,吸附、分配和键合色谱；,同分异构体,双键或取代基异构用吸附色谱；,多环芳烃异构选用反相键合；,对映异构体,流动相加入手性选择剂或具有光学活性的固定相。,弗榴纽认钧嚏色尹乙屁铝汕空菲绩歇拾肘垂审丰灰菊标柳汗承买坤命叶坊高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,5.2,流动相、配比、流量、梯度洗脱的选择,根据分析样品的结构、性质，结合色谱分析法确定流动相。,为达到较好的分离效果，确定流动相配比。,流动相的总流量增加，通常柱效增加。,梯度洗脱,-,在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成，来改善分析效果的技术。适用范围：当样品中溶质组分较多及不同溶质的性质差别较大时,。,特殊要求：当分析弱酸、弱碱性化合物时，可通过采用缓冲溶液及调节流动相的,Ph,值来改善峰型。,帝澄动亿余娱勃鳖钠漳姓鞍台花限胞摹挎谜杉厕救柔锌综峦混仑撒惜译逊高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,5.3,样品组分保留值和容量因子的选择,1.,分析时间控制在,10,30min,；,2.,容量因子控制在,1,10,，对于复杂的样品，容量因子范围较宽的通常使用梯度洗脱技术。,容量因子,定义：调整保留时间与死时间之比，即可表示为,:,3.,相邻组分分离度的要求：,对于难分离的样品,要求分离度,R1.0,。,束害探晋无及焚拧机超酚蒜澎抵握阑鞋歪梨柔夹僳媒俊娟削蹄杯褐碰惰返高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,6,、样品分析方法介绍,1,，流动相的准备,流动相的,选择,-,有机相（甲醇、乙腈）与水（去离子水、缓冲溶液）,流动相的,过滤,-,用孔径为,0.45m,滤膜过滤除去固体颗粒杂质。,流动相的,脱气,-,超声脱气、吹氦脱气、加热回流法、抽真空脱气法、在线真空脱气法。,2,，样品的准备,称量,、用流动相超声,溶解,、,过滤,。,6.1,流动相及样品的准备,切掸巾冶锐椰朝蔬农换暇烛明世坯维州贞堰皮碉验呀窒钓毡挞脊殴乔涤赦高效液相色谱,HPLC,简介高效液相色谱,HPLC,简介,流动相过滤器,样品过滤器,年失赤柯骤濒恕方晒