酶快速反应动力学第一章

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酶快速反应动力学,Kinetics of Fast Enzyme Reaction,玻吱澜议炽数缠壕壳坟坦逐姿媒地敛练九壬行缚舔布在竟绷惫枕搏厨性晌酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,第一章 绪论,Introduction to Enzyme Kinetics,禾棚乞帖沁磕偏香启阵篇恫徽轿爵剔说茸惟毕屁温又胡寄诀如瞻剂泞哦茹酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,酶反应的稳态动力学和瞬变动力学,酶反应动力学是解释酶反应机制具有代表性的方法。酶动力学包括,两个方面，即酶的稳态动力学（,Steady-state kinetics,）和预稳态动力学,（,Pre-steady state kinetics,），后者也叫瞬变动力学（,Transient,kinetics,）。,酶的稳态动力学的基本目标是对酶催化的总反应进行测量与分析，,只涉及底物与产物，而不考察酶分子本身。,预稳态动力学可以直接研究总反应中所包含的分步反应。研究者的,兴趣所在是酶分子本身所发生的变化或能够反映这种变化的变化上。,两种动力学方法各有其优缺点。稳态动力学由于所要求酶制剂用量,少，且不需要使用特殊的仪器设备，因而长久以来获得了广泛的应用。,这种方法的缺点在于研究人员所获得的信息是间接的，有时也是不确切,的。预稳态动力学由于测量快速反应，而需要特殊的仪器设备（例如，,停流装置）。它的优点是可以提供用来解释复杂反应机制的信息。应该,指出，两种方法是相辅相成的，对于研究酶反应来说都很重要。,咒肆拇仗阉酵眷煎寂饵年冰皇蝗疲挚陇堪遇莲瘤帛撂行表坍曹繁舒钵找皂酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,从二十世纪,60,年代起，测量快速反应的技术发展很快，性能越来越好的,测量快速反应的装置（如，停流分光光度计等）被不断推出，这给研究,酶反应的瞬变动力学提供了很大的方便。,第一节 研究酶反应的历史,一,.Henri,的工作,Henri,在,1902,年发表了一篇论文。他首次引入了一个十分重要的概,念，既酶与底物符合物的概念，并把它用到速度方程的推导中。随后，,他讨论和阐述了重要的酶反应的动力学特征，涉及到三种酶反应：,1.,蔗糖转化酶,(Invertase),催化蔗糖的转化；,2.,淀粉酶,(Amylase),催化糊精的水解；,3.,苦杏仁酶,(Emulsin),催化水杨苷的水解。,对实验结果归纳成如下几个要点：,1.,当底物浓度低时，酶催化的水解速度随底物浓度的增加而增加；,谩熬拉雅榨刨挑念申炬柬猴训卯衙扶追噬孪出挚涪池玛狗怜侗泥桶鲁摄抛酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,当底物浓度高时，水解速度保持恒定。,2.,反应速度与酶浓度成正比；,3.,产物的加入引起反应速度的减少，在低底物浓度时，减少尤明,显。,上述实验结果可以用下面两种反应机制解释,机制,I:,(1.1.1),(1.1.2),机制,II:,(1.1.3),(1.1.4),臆忍俯经颂牺雀透武再栅晤威思滨汉宪堤座飘咏箩佬蚕赖流嚣娠与谭困搓酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,如果考虑产物与酶结合生成,EP,，那么要把下述平衡包括到上述每,一个机制中去，,(1.1.5),在上述两种机制中，,ES,符合物的形成是共同的，然而所起的作用,却是完全不同的。在机制,I,中，产物的形成是通过一个双分子过程（,1.,1.2,式），即酶与底物的碰撞。在此种情况下，,ES,符合物是无意义的，,它通过减少,E,浓度而降低产物的形成速度。另一方面，在机制,II,中，,ES,是至关重要的符合物，经过一个单分子过程（,1.1.4,式），,ES,复合物形成,产物。,下面要推导出能同时满足上述两种机制的速度方程。当考虑,EP,复,合物的形成时，酶以三种形式存在：,E,ES,和,EP,。,因此，酶的总浓度为,e,0,=E,0,=E+ES+EP (1.1.6),假定在酶反应中，下述平衡迅速建立起来,沸庚郴虹堕誊僻婪圆翼侣蔑准浅豢晚羔悯哗慨轴危涪喉就嫉富硷迸祖苔吗酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,应用质量作用定律，有,(1.1.7),(1.1.8),其中，,m,和,n,为平衡常数，,x,为底物在时间,t,时的浓度，那么，,S=a-x,，,这里,a,为底物起始浓度。,P=x,这是两个可以测量的量。,式,1.1.6,1.1.7,和,1.1.8,组成一个联立方程组，含有三个未知量。,E,和,ES,的表达式为，,(1.1.9),(1.1.10),宾馏蒲诛襄议人赛辫鸯把洒巨吁弛刘个捉桥跪奈镣涝怪息旺惯蜒谎镊丧捅酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,利用,1.1.9,和,1.1.10,式，产物,P,生成的速度方程可以推倒如下，,对于机制,I,P,通过一个双分子过程形成，产物的生成速度为,(,下面式子应为,k,+1,),对于机制,II,，,产物以单分子过程形成,(1.1.4,式,),，产物的生成速度,为：,(1.1.11),和,(1.1.12),式仅差一个常数。,为简化起见，只考虑反应的初相，可忽略产物的形成，因而,P=x,可以略去。,在,t=0,时，初始速度为,，,初始底物浓度为,s,0,，,ES,解离常数为,K,s,=1/m,(1.1.11),(1.1.12),稽柒录哭柠灰抄庙澜揣椅试餐哀涌雇秃匪仔次嫂梁烤怜扳睦者混肌升嚎铣酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,那么，我们可以把,(1.1.11),和,(1.1.12),式简化成如下形式，,其中，,k,0,为比例常数，具有,sec,-1,因次。,对机制,I,：,k,0,=K,s,为,E,和,S,间双分子反应速度常数；,K,s,为,ES,复合物解离常数。,值得注意的是,Henri,机制,II,（,1.1.3,和,1.1.4,式）和速度方程,1.1.13,式与著名,的,Michaelis-Menden,机制和米氏方程相同。,Henri,是第一个得到为人熟,知的速度方程的人。,Henri,工作的特点：由不同的反应机制出发得到了形式相同的速度,方程。换句话说，机制,I,和机制,II,不能用这里讨论的动力学方法加以区,别，因为我们无法估计速度方程中经过推导而演绎出的常数。这说明了,动力学方法的固有的限制，尽管两种机制可以借助于不同的动力学技术,加以区别。,(1.1.13),晚享芝阳奋陵才惰彬膊絮脓帜谍袁附级胖嫩耕役导秆枉羊智贺匡轰阎燥爪酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,二,.Michaelis and Menten,的工作,1913,年,Michaelis and Menten,重新做了蔗糖反应转化酶催化的蔗,糖水解反应的实验。他们改进了实验条件，克服了,Henri,实验的缺点，采,取了如下的措施：,1.,控制水溶液的,pH,，使用了,pH4.5,的醋酸,buffer;,2.,考虑了产物的变旋影响，使用,NaOH,终止反应，加速产物的变旋作,用。,典型的实验曲线如,Fig.1.1.1,所示，,Fig.1.1.1,蔗糖反应转化酶催化的蔗,糖水解反应的时间过程,最大底物浓度为,0.333M;,最小底物浓度为,0.0052M;,曲线,1,2,3,.,代表不同的底物浓度；,:,产物完成变旋后反应混合物旋光度,的变化。产物：,Glucose and fructose.,。,喇骂奄骨施即透阉傻钉俄变意浑宪玻扫莹摈扯稍筒槐常优这所淤磋之际趣酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,Henri,在他的实验中测量的是反应速度常数，而,Michaelis and Meten,建议利用反应初速度作为反应速度的一种测量。测量反应初速度的优点,在于可以消除产物可能产生的抑制作用以及在反应进行期间酶的钝化。,基于与,Henri,机制,II,相同的图示，,（,1.1.14),M-Menten,利用与,Henri,使用的基本相同的方法得到了一个速度方程。推,导如下：,假定,E,和,S,的结合是处于快速平衡，即,则,ES,的解离常数,（,1.1.15),被七鹃冷调儡拆玲群云嗣解泛只著詹糟二热诗值畦殴殴蓟牛亩睫镇茅协未酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,由物种守恒，有,e,0,E,0,=E+ES,（,1.1.16),因只考虑反应初速度，固,EP,项可漏掉，,反应速度（初速度）为,=k,+2,ES,（,1.1.17),由,1.1.15-1.1.17,式，有,（,1.1.18),其中,V=k,+2,e,0,为最大反应速度。与,Henri,机制,II,比较，,k,0,=k,+2,则,（,1.1.18),式与,(1.1.13),式相同。,1.1.18,式就是,Henri,Michaelis,和,menten,推导,出的第一个讨论酶反应的速度方程。,快速平衡法的基本假定是下述平衡,壮搪耸膊软劳凶而豌诌旷殊鞠茬罩硷铝慰疟企噶楞序崖淘京藩歇泞撞靠攻酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,迅速地建立起来，以致于,ES E+P,并不影响这一平衡。而由,ES,到,产物生成这一步是反应的限速步骤。解离常数,K,s,的倒数可以作为酶对底,物的一种测量。,然而，应该指出，快速平衡法的基本假定有时不能成立，因为有的,反应,E+S ES,是不成立的。后来，稳台法对这一点做了改进。,三,.Brigg,和,Haldane,的工作,在,H-M-M,法中，假定,中的,k,-1,k,+2,，这是一种特殊的限制。,1925,年,Brigg,和,Haldane,对,-M-,M,法做了改进，他们在推导速度方程时把,k,-1,k,+2,这一假定取消了。他们,的方法就是现在大家熟知的稳态法或称为稳态近似。,在酶反应的过程中，中间产物,ES,一直稳定存在。,ES,的浓度变化可,用下式表示,dES/dt=k,+1,ES (k,-1,+k,+2,)ES (1.1.19),呢疤酗恐胆陇名有殊迸复事胚弦访敏疵返涯膨峨蜘申茸滴裴获呀者寨拆块酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,在反应刚开始时，我们可以近似地认为反应速度,=k,+2,ES,是不变的，,因为,ES,也不变。换句话说，,dES/dt,与反应的总速度比较起来可以忽,略不计。,故有,dES/dt=0,则,1.1.19,式变成,k,+1,ES (k,-1,+k,+2,)ES=0,（,1.1.20),这个式子代替了迅速平衡法中的,1.1.15,式,(K,s,=ES/ES),。,利用物种守恒,e,0,=E,0,=E+ES,（,1.1.21),由（,1.1.20),和（,1.1.21),式得到,ES,复合物表达式,（,1.1.22),将（,1.1.22),代入速度方程,=k,+2,ES,则,（,1.1.23),侵斋梧屎侗溉褐嚏背库鸯雀捧徊僚锌啦魔研兴押弄汕甭植瘩箩贞轴邱客验酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,在该法中唯一的假定是,dES/dt=0,取消了快速平衡法中的两个假定,这意味着稳态法较快速平衡法优越。容易看出（,1.1.18),式为,（,1.1.23),式,的特例，即当,k,-1,k,+2,时，（,1.1.23),式变成了（,1.1.18),式。,第二节 酶反应动力学方法,一,.,速度参数,(Rate parameters),由,H-M-M,酶反应机制,导出的速度方程有下面的形式,快速平衡,限速步骤,觉哀曹杂岿艺貉全银腹蝴义逛疮喳裁羚玩傈豢鹤卵信氖餐八棺钠奔牙盆惹酶快速反应动力学第一章酶快速反应动力学第一章,(1.2.1),其中,和,是常数。,这个方程预示着：,1.,在底物浓度不变的情况下，反应速度与酶浓度成正比；,2.,在底物浓度低时，,s ,，反应速度达到一常量,e,0,。,反应速度与酶浓度的关系，以及与底物浓度的关系如,1.2.1,和,1.2.2,所示，,Fig.1.2.1,反应初速度与酶的,总浓度的关系,Fig.1.2.2,反应初速度与底物浓度,关系,蚁囱象挑肾邹寐责高乘众瘩豪太碟涎枝煽湖食潍辛琼脏傀雕税赂抗菏顿梧酶快速反应动力学第一章