第12章荧光分析法

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十二章,荧光分析法,光致发光,：物质受到光照射时，除,吸收,某种波长的光之外还会,发射,出比原来所吸收的波长更长的光，这种现象称为光致发光。,荧光,：物质分子接受光子能量被激发后，从,激发态的最低振动能级返回基态,时发射出的光。,荧光分析法,：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质,鉴定,和,含量测定,的方法。,特点：,1,）灵敏度高,2,）选择性好,3,）方法简单快速，用样量少,4,）应用受限,第一节 荧光分析法的基本原理,一、分子荧光,（一）分子荧光的产生,（二）荧光的激发光谱和发射光谱,二、荧光与分子结构,三、影响荧光强度的外部因素,一、分子荧光,（一）分子荧光的产生,1,、分子的电子能级与激发过程,基态,+,hv,激发态,光谱中电子能级可分为二组：,1,）电子,自旋配对,的（电子自旋方向,相反,，电子的净自旋,S=0,，谱线多重性,M=2S+1=1,）称为单重态或单线态，以,S,表示。,2,）电子,自旋非配对,的（电子自旋方向,相同,，其净自旋,S=1,，谱线多重性,M=3,）称为三重态或三线态，以,T,表示。,激发单重态与相应的三重态的区别在于电子,自旋方向,不同及三重态的,能级,稍低一些。,三重态寿命较长。,2,、荧光的产生,基态,光辐射,激发态,基态,释放能量,振动弛豫,（,vibrational relexation,）,处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞，能量传递给溶剂分子，电子返回到同一电子激发态的最低振动能级。,特点,：,无辐射,跃迁；只能在,同一电子能级内,进行；时间约为,10,-12,s,；使大多数电子激发态处于其最低振动能级上。,内部能量转换,（,internal conversion,）：内转换,两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。,特点,：,无辐射,跃迁；两个电子激发态具有,相同的多重性,（都是单重态或都是三重态，如,S,2,*,S,1,*,，,T,2,*,T,1,*,）。,处于激发单重态的分子通过振动弛豫和内转换，均可返回到,第一激发单重态的最低振动能级,。,荧光发射,处于第一激发单重态最低振动能级的电子以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，发射的光量子称为荧光。,特点,：,1,）,发射光量子,，且荧光波长总是长于激发光波长；,2,）时间约为,10,-9,-10,-7,s,；,3,）荧光谱线有时呈现几个非常,接近的峰,（电子返回到基态不能振动能级，能级差不同，吸收波长不同）；,4,）处于基态不同能级的电子会通过振动弛豫返回到基态最低振动能级。,外部能量转换,（,external conversion,）：外转换,溶液中的激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子之间相互碰撞而失去能量，并以,热能,的形式释放能量的过程。,特点,：,无辐射跃迁,；常发生在第一激发单重态或激发三重态的,最低振动能级返回基态,的过程；,降低荧光强度,。,体系间跨越,（,intersystem crossing,）,处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。如,S,1,*,的最低振动能级同,T,1,*,的最高振动能级重叠，则可发生体系间跨越（,S,1,*,T,1,*,）。,特点,：,无辐射跃迁,；发生在,不同多重态,之间（,S,1,*,T,1,*,）；含有,重原子,如溴、碘等的分子，或溶液中存在氧分子等,顺磁性,物质容易发生；,使荧光减弱,。,外转换及体系间跨越使,荧光减弱甚至消失,。,磷光发射,分子从单重态以体系间跨越跃迁到三重态后，再经振动弛豫回到,三重态最低振动能级,，,返回至基态,的各个振动能级而发出光辐射，称为磷光。,特点：,1,）,发射光量子,，磷光波长较荧光更长；,2,）时间较长，,10,-4,-10s,，甚至更长；,3,）光照停止后，可持续一段时间；,4,）在室温下很少产生磷光。,S,2,S,1,S,0,T,1,吸,收,发,射,荧,光,发,射,磷,光,系间跨越,内转换,振动弛豫,能,量,l,2,l,1,l,3,外转换,l,2,T,2,内转换,振动弛豫,（二）荧光的激发光谱和发射光谱,激发光谱,（,excitation spectrum,）：,不同激发波长,的辐射引起物质发射,某一波长荧光,的相对效率。,绘制：固定发射波长，荧光强度（,F,）对激发波长（,ex,）的关系曲线，其形状与吸收光谱相似。,荧光光谱,（,fluorescence spectrum,）：在所发射的,荧光中各种波长,组分的相对强度。,绘制：固定激发光波长和强度，荧光强度（,F,）对发射波长（,em,）的关系曲线。,荧光分析法通常采用,ex,max,与,em,max,。,荧光光谱特征：,1,、,斯托克斯位移,（,Stokes shift,）：荧光发射波长总是大于激发光波长的现象。,原因,：,1,）激发态分子通过,振动弛豫和内转换,到达第一激发单重态最低振动能级；,2,）荧光发射可能使激发态分子返回到,基态的不同振动能级,；,3,）激发态分子,与溶剂分子的相互作用,。,2,、荧光光谱的形状与激发波长无关,基态分子跃迁到不同的激发态（如,S,1,*,，,S,2,*,），吸收不同的波长（如,1,，,2,），所以吸收光谱可能有几个吸收带；但均回到,第一激发单重态最低振动能级,后再发射荧光返回到,基态,，所以荧光发射光谱只有一个发射带。,3,、荧光光谱与激发光谱的镜像关系,蒽的激发光谱：,a,峰,为,S,0,S,2,*,形成。,b,峰,由,b,0,、,b,1,、,b,2,、,b,3,、,b,4,组成，为,S,0,S,1,*,各不同振动能级而形成。,蒽的荧光光谱：,包含,c,0,、,c,1,、,c,2,、,c,3,、,c,4,等小峰，为,S,1,*,(v=0),S,0,各不同振动能级而发出光辐射所形成。,二、荧光与分子结构,（一）荧光寿命和荧光效率,荧光寿命,（,fluorescence life time,）：除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的,1/e,所需的时间，常用,f,表示。,F,t,=F,0,e,-,Kt,t=,f,时，,F,t,=(1/e)F,0,ln(F,0,/F,t,)=t/,f,直线斜率即为,1/,f,荧光效率,（,fluorescence efficiency,）：,荧光量子产率（,fluorescence quantum yield,），指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光,子数之比，常用,f,表示。,f,=,发射荧光的光子数,/,吸收激发光的光子数,一般物质的荧光效率在,0-1,之间。大小取决于物质分子的,化学结构及环境,（温度、,pH,、溶剂等）。,荧光效率越高，荧光强度越强。,（二）有机化合物分子结构与荧光的关系,能够发射荧光的物质同时具备两个条件：,1,）有强的,紫外,-,可见吸收,2,）有一定的,荧光效率,长共轭,分子较强紫外吸收,刚性平面,结构分子较高荧光效率,1,、,长共轭结构,具有,*,跃迁,大多数产生荧光的物质都含有,芳香环或杂环,，,电子共轭程度越大，荧光强度越大，荧光波长也长移。,2,、,分子的刚性,-,共平面性,分子刚性,-,共平面性越强，荧光效率越大，荧光波长越长。,3,、,取代基,1,）,给电子取代基,，如,-NH,2,、,-OH,、,-OCH,3,、,-NHR,、,-NR,2,、,-CN,等，能增加分子的,电子共轭程度，常使荧光效率提高，荧光波长长移。,2,）,吸电子取代基,，如,-COOH,、,-NO,2,、,-C=O,、,-NO,、,-SH,、,-NHCOCH,3,、,-F,、,-Cl,、,-Br,、,-I,等，减弱分子的,电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄灭。,3,）取代基对,电子共轭体系,作用较小,，如,-R,、,-SO,3,H,、,-NH,3,+,等，对荧光影响也不明显。,（三）荧光试剂,弱,/,无荧光物质,+,荧光试剂强荧光产物,1,、荧光胺（,fluorescamine,）：,特点,：与脂肪族和芳香族,伯胺,形成高度荧光衍生物。,荧光胺及其水解产物均不显荧光。,荧光条件,：,ex,=275/390nm,，,em,=480nm,。,2,、邻苯二甲醛（,OPA,）：,特点,：在,2-,巯基乙醇存在下，,pH9-10,的缓冲溶液中能与,伯胺,类、特别是半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸外的,-,氨基酸,生成灵敏的荧光产物。,荧光条件,：,ex=340nm,，,em=455nm,。,例：测定磺胺类药物,3,、,1-,二甲氨基,-5-,氯化磺酰萘（,Dansyl-Cl,，,DANS-Cl,，丹酰氯）：,与,伯、仲胺,及,酚基,的生物碱反应生成荧光物质。,丹酰肼（,Dansyl-NHNH2,）：,与可的松等的,羰基,缩合，产生强烈荧光。,荧光条件,：,ex,=365nm,，,em,=500nm,。,含胺基药物的测定,雌激素的测定,4,、测定无机离子的荧光试剂,无机离子,+,有机化合物配合物直接测定荧光强度,加入无机离子（如,CN,-,、,F,-,等）,配合物荧光减弱或消失,荧光猝灭法,三、影响荧光强度的外部因素,1,、,温度,：温度荧光效率，荧光强度,原因：温度升高，分子运动速度加快，分子间碰撞几率增加，使无辐射跃迁增加，从而降低了荧光效率。,2,、,溶剂,：,1,）溶剂,极性,：极性荧光波长，荧光强度,原因：极性溶剂中，,*,跃迁能量差,E,小，使紫外吸收波长和荧光波长均长移；跃迁几率增加，使荧光强度增强。,2,）溶剂,粘度,：粘度荧光强度,原因：溶剂粘度低，分子间碰撞机会增加，使无辐射跃迁增加，使荧光减弱。,温度溶剂粘度荧光强度,3,、,酸度,：,荧光物质,本身是弱酸或弱碱,时，溶液的酸度对其荧光强度有较大影响，因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，因此荧光强度也有差异。,如苯胺：在,pH7-12,溶液中主要以分子形式存在，发生蓝色荧光；,pH13,的溶液中均以离子形式存在，不发射荧光。,4,、,荧光熄灭剂,：,荧光熄灭,：荧光猝灭，指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。,荧光熄灭剂,：引起荧光熄灭的物质，如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。,作用机制,：,1,）荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；,2,）荧光物质分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配位化合物；,3,）溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进体系间跨越，激发单重态的荧光分子转变至三重态；,4,）浓度较大（超过,1g/L,）时，发生自熄灭现象。,荧光熄灭法,（,fluorescence quenching method,）：荧光物质在加入某种熄灭剂后，,荧光强度的减弱和荧光熄灭剂的浓度呈线性关系,，利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量的方法。,5,、,散射光,：,一束平行单色光照射在液体样品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于,光子和物质分子相碰撞,，使光子的运动,方向发生改变,而向不同角度散射，这种光称为,散射光,。,瑞利光,：仅运动方向改变，无能量交换。,拉曼光,：运动方向改变，并有能量交换，波长较入射光稍长或稍短。,对荧光测定干扰的主要是,波长比入射光波长更长的拉曼光,。,消除：选择适当的激发波长。,6,、其它,内滤光作用,：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为内滤光作用，如色胺酸中的重铬酸钾。,自吸收现象,：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收，如蒽化合物。,第二节 荧光定量分析方法,一、荧光强度与物质浓度的关系,溶液的荧光强度,该溶液中荧光物质吸收光能的程度,荧光效率,条件：极稀溶液,二、定量分析方法,1,、校正曲线法：,以