流式细胞仪培训课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流式细胞仪原理与应用,陈玉婵,流式细胞仪原理与应用陈玉婵,1,提 要,流式细胞仪简介,流式细胞仪工作原理,流式实验流程,流式细胞术的应用,提 要流式细胞仪简介,2,流式细胞术的发展史,1930s1950s:开始出现自动细胞分析技术（细胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动计数器。）,1960s晚期发展：荧光检测细胞计、细胞分选器检测细胞的荧光信号、单克隆抗体技术,1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。,流式细胞术的发展史1930s1950s:开始出现自动细胞分,3,什么是流式细胞仪？,在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器,仪器特点：单个细胞通过狭窄激光束，产生能够反映细胞大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标记的细胞成分能发射出不同的荧光。,Injector,Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,Sheath,fluid,什么是流式细胞仪？在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的,4,流式细胞仪的检测对象,藻类细胞,染色体,血细胞,原生动物细胞,任何存在于悬液中的直径为,0.2-50微米,的粒子或细胞都适用于流式分析,流式细胞仪的检测对象藻类细胞染色体血细胞原生动物细胞任何存在,5,流式细胞仪工作原理示意图,流式的基本组成：,1.流动室和 液流系统,2.光路系统,3.电系统,流式细胞仪工作原理示意图流式的基本组成：,6,流式细胞仪可提供的信息,物理信息：通过散射光信号反映,相对细胞大小,相对细胞颗粒密度和内部复杂度,荧光信息：通过荧光强度反映,流式细胞仪可提供的信息物理信息：通过散射光信号反映,7,散射光信号的产生,488nm激光产生散射光,散射光信号的产生488nm激光产生散射光,8,1.散射光信号,前向角散射光（,FSC,Forward Scatter）,入射激光的,同向,散射光信号,反映细胞相对,大小及其表面积,侧向角散射光（,SSC,Side Scatter）,入射激光,90,角,的,散射光信号,反映细胞,粒度及细胞内相对复杂性,1.散射光信号前向角散射光（FSC,Forward Sca,9,散射光,散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异,通常使用“散点图”来看散射光信号,散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据,散射光散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异,10,利用散射光信号对混合细胞分群,利用散射光信号对混合细胞分群,11,2.荧光信号,荧光素与特异抗体结合,荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强,2.荧光信号荧光素与特异抗体结合,12,荧光信号的表示方法,双参数点图,单参数直方图,荧光信号的表示方法双参数点图单参数直方图,13,一个完整流式实验的组成,样品的处理,调整仪器条件,数据处理,一个完整流式实验的组成,14,1.,样品处理,单细胞悬液的制备,浓度,5,10,5,1 10,6,/mL,外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网,300目,过滤)制成单细胞悬液,选择合适的荧光染料染色,必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发,激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内,荧光素光谱的重叠应当尽量减少,1.样品处理单细胞悬液的制备,15,2.仪器条件的确定,电压,阈值,荧光补偿（多色分析）,2.仪器条件的确定电压,16,处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号通过光电探测器转换成电信号（电压）。调整电压，可使信号强度改变。,BD流式细胞仪有两种类型的光电探测器：光电二极管和光电倍增管（PMTs）。,PMT用于检测较弱的SSC信号和荧光信号，光电二极管用于检测较强的FSC信号,电压,处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号通过光电探,17,阈值,阈值：,信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。,阈值阈值：信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片,18,荧光补偿,采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差,荧光补偿采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差,19,荧光补偿,荧光补偿,20,补偿调整的实验过程,样本准备：阴性样本，单阳性样本,调整：第一步：阴性样本调整所有PMT,第二步：单阳性样本调整补偿,判断标准：,补偿调整的实验过程样本准备：阴性样本，单阳性样本,21,补偿模型,PE-X%FITC,补偿前,补偿后,FITC单染,补偿模型PE-X%FITC补偿前补偿后FITC单染,22,数据分析,设门,设定阴性与阳性群体的界限,确定阳性与阴性细胞群体,统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数,数据分析设门,23,设门,设门的意义：选定要分析的目标细胞,设门设门的意义：选定要分析的目标细胞,24,设门,设门,25,如何设定阴性与阳性的界限,如何设定阴性与阳性的界限,26,流式检测结果的表示方法,百分率,绝对计数,平均荧光强度,图形：直方图、散点图,流式检测结果的表示方法百分率,27,流式细胞仪可以告诉我们什么？,流式细胞仪可以告诉我们什么？,28,流式细胞术的细胞学应用,细胞结构,细胞大小,细胞,流式细胞术的细胞学应用,粒度,细胞表面面积,核浆比例,DNA含量与细胞周期,RNA含量,蛋白质含量,染色体分析,细胞功能,细胞表面/胞浆/核的特异性抗原,细胞活性,细胞内细胞因子,酶活性,激素结合位点,细胞受体,细胞凋亡,流式细胞术的细胞学应用细胞结构细胞功能,29,流式细胞仪在微生物研究中的应用,DNA,蛋白,过氧化物生成,胞内pH,鉴别死/活细菌和酵母菌并计数,区分革兰氏阳/阴性细菌,研究酵母菌细胞器,基因表达-绿色荧光蛋白,病原菌与吞噬细胞的关系-吞噬引起的呼吸爆发,病毒-细胞相互作用：病毒感染导致细胞蛋白表达的改变，对细胞周期的干扰，对细胞内钙离子水平的影响,病毒引起的凋亡,流式细胞仪在微生物研究中的应用DNA,30,流式细胞仪的临床应用,HIV免疫分型，CD4绝对计数,白血病和淋巴瘤的免疫分型,肿瘤的细胞周期和倍体分析,网织红细胞计数,细胞移植的交叉配型和免疫状态监测,干细胞计数,残量白血病细胞检查,HLA-B27检查,血小板功能及相关疾病,流式细胞仪的临床应用HIV免疫分型，CD4绝对计数,31,补偿调整实验,补偿调整实验,32,藻类细胞绝对计数,藻类细胞绝对计数,33,细胞周期分析,DNA含量分析-PI染色,细胞周期分析DNA含量分析-PI染色,34,流式细胞仪培训课件,35,细胞凋亡,细胞膜分析-PS外翻,PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白Annexin-V可与PS结合,细胞凋亡细胞膜分析-PS外翻,36,细胞凋亡,细胞凋亡,37,细胞生理学研究,Ca,2+,流动性检测,Ca,2+,是非常重要的细胞内离子，在胞膜到胞浆的信号转导中起重要的作用。细胞受到刺激后，胞内Ca,2+,浓度会发生改变。,最常用的染料,Indo-1 excited at UV,Fluo-3 excited at 488nm,Fura red excited at 488nm,细胞生理学研究Ca2+流动性检测,38,细胞生理学研究,细胞活性分析,Fluorescein Diacetate进入活细胞后,被胞内酯酶降解,生成荧光底物.活细胞会发绿色荧光,细胞生理学研究细胞活性分析,39,细胞生理学研究,细胞膜电位的改变,超极化的细胞摄取更多的染料，细胞总的荧光强度增大；细胞去极化时，染料释放到细胞外，总的荧光强度减少,。,染料和试剂,DiOC,6,(3)DiOC,5,(3)DiOC,1,(3)DiOC,1,(5),Valinomycin Gramicidin D CCCP,细胞生理学研究细胞膜电位的改变,40,细胞内标记,胞内多种肽类已被成功标记，包括病毒颗粒、免疫球蛋白、雌激素受体、细胞因子、特殊蛋白如Bcl-2和cyclooxygenase.,胞内细胞因子,磷酸化蛋白,细胞内标记 胞内多种肽类已被成功标记，包括病毒颗粒、免疫球,41,1,、有事业的峰峦上，有汗水的溪流飞淌；在智慧的珍珠里，有勤奋的心血闪光。,2,、人们走过的每一个足迹，都是自己生命的留言；留给今天翻过的日历，留给未来永久的历史。,3,、人生是一座可以采掘开拓的金矿，但总是因为人们的勤奋程度不同，给予人们的回报也不相同。,4,、理想之风扯满人生的帆；奋斗之杆举起理想之旗。,5,、人应该学会走自己的路，但更应该掌握手中的罗盘。,6,、不能因为人生的道路坎坷，就使自己的身躯变得弯曲；不能因为生活的历程漫长，就使求索的脚步迟缓。,7,、人生的意义在理想的光辉中闪烁；生命的价值在创造的生活中闪现。,8,、只有走完平凡的路程，才能达到伟大的目标。,9,、奋斗目标是人生的精神支柱。,10,、共同的事业，共同的斗争，可以使人们产生忍受一切的力量。,奥斯特洛夫斯基,11,、属于每个人的道路，都在每个人的足下；属于每个人的历史，都在每个人的身后。,12,、终于有一天，海水和泪都是甜的。,13,、有志者自有千方百计，无志者只有千难万难。,14,、贫不足羞，可羞是贫而无志。,吕坤,15,、人，只要有一种信念，有所追求，什么艰苦都能忍受，什么环境也都能适应。,丁玲,16,、人生的途程是遥远的，只要双脚不息地前行，道路就会向远方延伸。,17,、理想是人生的坚实支柱，如果失去了生活的理想，精神也就会随之而瘫痪。,18,、目标不是都能达到的，但它可以作为瞄准点。,28,、我学习了一生，现在我还在学习，而将来，只要我还有精力，我还要学习下去。,别林斯基,29,、任何时候我也不会满足，越是读书，就越是深刻的感到不满足，越是感到自己的知识贫乏。,马克思,30,、外国语是人生斗争的一种武器。,马克思,31,、学习这件事不在乎有没有人教你，最重要的是在于你自己有没有觉悟和恒心。,法布尔,32,、笔落惊风雨,诗成泣鬼神。,杜甫,33,、别裁伪体亲风雅,转益多师是汝师。,杜甫,28,、我学习了一生，现在我还在学习，而将来，只要我还有精力，我还要学习下去。,别林斯基,29,、任何时候我也不会满足，越是读书，就越是深刻的感到不满足，越是感到自己的知识贫乏。,马克思,30,、外国语是人生斗争的一种武器。,马克思,31,、学习这件事不在乎有没有人教你，最重要的是在于你自己有没有觉悟和恒心。,法布尔,32,、笔落惊风雨,诗成泣鬼神。,杜甫,33,、别裁伪体亲风雅,转益多师是汝师。,杜甫,1、有事业的峰峦上，有汗水的溪流飞淌；在智慧的珍珠里，有勤奋,42,