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单击以编辑母版标题样式,单击以编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,以NF-B为靶点的缺血性急性肾衰,基因治疗的实验研究,导 师,研究生,以NF-B为靶点的缺血性急性肾衰导 师,1,立论依据,立论依据,2,急性肾功能衰竭（ARF)的概况,发病率：2.5；,死亡率：高，50；,治疗方法：透析；,改善预后的关键：是在阐明其发病机制的基础上进行有效的针对性治疗,。,急性肾功能衰竭（ARF)的概况 发病率：2.5；,3,急性肾功能衰竭,(ARF),的发病机制与一些因子有关,单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),细胞间黏附分子-1（ICAM-1）,内皮素（endothelin,ET）,游离型一氧化氮合酶iNOS,急性肾功能衰竭(ARF)的发病机制与一些因子有关 单核细胞,4,免疫因子的表达、平衡受到转录因子的调控,免疫因子的表达受到转录因子NF-B 的调控。,免疫因子的表达、平衡受到转录因子的调控 免疫因子的表达受到转,5,NFB,可由多种激活剂激活，由无活性的结合状态经磷酸化后活化，易位到细胞核内，与特异性的结合位点（,B,位点）结合，启动基因的转,录,NFB可由多种激活剂激活，由无活性的结合状态经磷酸化后活化,6,研究转录因子在疾病发病中的作用并进行干预，可在更早期阻断发病环节，起到“提纲挈领”“事半功倍”的效果,。,研究转录因子在疾病发病中的作用并进行干预，可在更早期阻断,7,NF-B 参与了缺血性ARF的发病,NF-B在肾病综合征、动脉粥样硬化、病毒感染和肿瘤发生中起一定作用；,我们的前期研究结果表明:NF-B 在缺血性ARF中活性升高；可能促进了早期、晚期肾损害的发生；是通过调控iNOS等炎性因子的表达来实现的。,NF-B 参与了缺血性ARF的发病 NF-B在肾病综合征,8,抑制,NF-B,的策略在疾病中研究,治疗心肌梗塞,恶性肿瘤的转移,抑制肾的排斥反应,实验性肾小球肾炎,抑制NF-B 的策略在疾病中研究 治疗心肌梗塞,9,NFB,decoy 作用的示意图,NFB decoy 作用的示意图,10,阳离子脂质体转染法,可能机制是：,DNA负电荷与脂质体上的正电荷结合，脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，然后通过二者的融合将DNA导入细胞,阳离子脂质体转染法可能机制是：,11,脂质体介导转染的机制,脂质体介导转染的机制,12,方法：HVJ脂质体DNA转染法以及缺陷；,鱼精蛋白(protamine)与阳离子脂质体和DNA一道，按一定的电荷比例制成复合物（LPD）进行体内、外转染，可提高基因转染效率,阳离子脂质体转染法,方法：HVJ脂质体DNA转染法以及缺陷；阳离子脂质体转染法,13,本研究,将,选择大鼠缺血性ARF模型，应用NF-B结合位点引诱物ODN进行体内外转染，通过观察对MCP-1,、,ICAM-1、iNOS,和,ET-1表达的影响，肾功能和,肾组织的,形态,学的,改变,观察其,对,肾细胞及肾功能,的,保护作用，为基因治疗提供理论依据。,本研究将选择大鼠缺血性ARF模型，应用NF-B结合位点引诱,14,研究内容、步骤和方法,研究内容、步骤和方法,15,研究内容,观察NF-B结合位点引诱物ODN 对体外刺激培养细胞的免疫因子产生的影响,观察NF-B结合位点引诱物ODN对缺血型,ARF,的预防和治疗作用。,研究内容 观察NF-B结合位点引诱物ODN 对体外刺激,16,研究步骤,体外转染：选用NRK-52E细胞株，观察转染后对表达,MCP-1,、,ICAM-1、ET-1,和,iNOS,的影响。,体内转染：在肾动脉阻断的同时以及再灌注后不同时间，经肾动脉给予NF-B结合位点引诱物ODN，进行观察。,研究步骤 体外转染：选用NRK-52E细胞株，观察转染后对,17,实验,方法,大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养,；,阳离子脂质体的制备,；,iARF 模型的制备；,肾动脉注射法。,实验方法 大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养；,18,大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养,本实验室已有传代的细胞株和成熟的方法,大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养本实验室已有传代的细,19,鱼精蛋白-脂质体,ODN/DNA(LPD),的制备,将ODN与鱼精蛋白、脂质体混合，使鱼精蛋白、脂质体与ODN/电荷比率为4,鱼精蛋白-脂质体ODN/DNA(LPD)的制备,20,脂质体体外转染的实验步骤,细胞接种到48孔培养板，培养过夜或使铺满达5080；,细胞培养液中加入LPD 使ODN终浓度为1 mmol/L，裸转染为直接将ODN与细胞孵育；,同时各孔加入TNF,使终浓度为50 ng/ml，设立空白对照，置37，CO,2,孵箱内，培养212 h。,脂质体体外转染的实验步骤 细胞接种到48孔培养板，培养过夜,21,体外分组,1.LPD组,2.裸转染组,3.空白对照组,体外分组,22,转染效率：,荧光显微镜观察胞内荧光素标记的NF-,B decoy ODN 的分布,FCM检测细胞摄入率。,NF-,B,活性,凝胶电泳迟滞分析（EMSA）,各免疫因子的表达：,mRNA表达的半定量RT-PCR分析,观察指标,转染效率：观察指标,23,肾脏内转染,戊巴比妥钠(sodium pentobarbital)50mg/kg,麻醉，并插管呼吸按本科建立的方法制备iARF模型；,用 30G 针将200,l LPD，注入左肾动脉;准备实验阶段用FITC标记LPD;,夹闭60min后，开始再灌注;,肾脏内转染 戊巴比妥钠(sodium pentobarbit,24,注射后2,12，24hr 处死大鼠，取出肾脏，做冷冻切片进行荧光显微镜检查，观察荧光的分布情况。,转染效率的观察,注射后2,12，24hr 处死大鼠，取出肾脏，做冷冻,25,体内转染分组,Sham 组,iARF 组,NF-,B decoy ODN 治疗组,错配物ODN治疗组,体内转染分组 Sham 组,26,肾功能检测及肾组织形态学的检查；,免疫组化检查 肾组织中的M/M,的分布；,EMSA检查肾组织的NF-,B 活性的变化；,RT-PCR和免疫组化检查MCP-1、ICAM ET-1和 iNOS mRNA的表达及其在肾脏中的分布。,观察指标,观察指标,27,可能遇到的问题及解决办法,虽然在设计体外实验部分的时候，已充分考虑到脂质体转染效率的影响因素如：+/-，脂质体本身的组成，但是，体内实验部分是否也能够在体外最佳条件下达到最佳效果。,肾动脉分离和注射的出血问题。,EMSA技术的难度,可能遇到的问题及解决办法 虽然在设计体外实验部分的时候，已充,28,初步结果,初步结果,29,图1 NRK-52E细胞转染效率FCM测定,1：空白对照；2.PL法转染；,3：裸转染,图1 NRK-52E细胞转染效率FCM测定,30,图2 NRK-52E细胞转染效率照片,A：PL法转染2 h后普通光镜观察；B：A视野的荧光镜观察。C：裸转染2 h后普通光镜观察；D：C视野的荧光镜观察。E：空白对照普通光镜观察；F：E视野的荧光镜观察。,N,胞转染,NFB,decoy 2h,后普通光镜下观察,图2 NRK-52E细胞转染效率照片,31,经肾动脉给药2h后，,NF-B,decoy 主要分布在肾小球,经肾动脉给药2h后，NF-B decoy 主要分布在肾小球,32,经肾动脉给药12h后，,NF-B,decoy 主要分布在肾小管,经肾动脉给药12h后，NF-B decoy 主要分布在肾小,33,下一步研究计划,NF-B,decoy 转染治疗后对ARF大鼠肾功能的影响：,生化学指标,组织学指标,观察肾组织中,NF-B及其下游的分子MCP-1、ICAM-1、iNOS、ET-1的变化：,EMSA,RT-PCR和免疫组化,恳请各位老师提出宝贵意见并予以指导。,下一步研究计划NF-B decoy 转染治疗后对ARF大鼠,34,谢谢大家,谢谢大家,35,
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