染色质免疫共沉淀实验方法简介教程课件

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Chromatin Immunoprecipitation Assay,(ChIP),染色质免疫沉淀实验,Chromatin Immunoprecipitation,1,基因表达:反式因子和顺式作用元件之间相互作用。,真核生物的基因组,DNA,以染色质的形式存在。,研究蛋白质与,DNA,在染色质环境下的相互作用是阐明真核基因表达机制的基本途径。,概述,原理,方法,比较,举例,基因表达调控,功能基因组学,基因表达:反式因子和顺式作用元件之间相互作用。概述基因表,2,染色质免疫沉淀实验,(CHIP),研究体内,DNA,蛋白质相互作用的重要工具。它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异,DNA,片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。,概述,原理,方法,比较,举例,染色质免疫沉淀实验(CHIP)研究体内DNA蛋白质相互作用,3,CHIP,原理,在活细胞状态下固定蛋白质,DNA,复合物,将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的,DNA,片段,对目的片断的纯化与检测,概述,原理,方法,比较,举例,CHIP原理在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物概述,4,概述,原理,方法,比较,举例,概述,5,操作步骤,一、固定,在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质,DNA,复合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。,二、免疫沉淀,利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原,-,抗体反应形成,DNA-,蛋白质,-,抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的,DNA,片段。,三、纯化与检测,经蛋白质与,DNA,解偶联，,DNA,片段纯化等处理后，用,PCR,等方法检测,DNA,与蛋白质的结合情况,.,概述,原理,方法,比较,举例,操作步骤一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质DNA复,6,概述,原理,方法,比较,举例,概述,7,注意事项,超声波破碎条件的选择,抗体量的选择,PCR,反应条件的选择,概述,原理,方法,比较,举例,Input,对照,阳性对照：如组蛋白抗体,阴性对照：阴性引物,条件选择,对照设置,注意事项超声波破碎条件的选择概述Input对照条件选择对照设,8,比较：,蛋白质-,DNA,相互作用常用方法,凝胶电泳迁移率改变分析,（,EMSA,）,DNase,足迹法（,foot printing,）,染色质免疫沉淀实验,(CHIP),体 内,体 外,概述,原理,方法,比较,举例,比较：凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）体 内体 外概述,9,EMSA,CHIP,由于许多转录调控蛋白有相似或相同的,DNA,结合位点，,EMSA,获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和,DNA,结合的状况,。,能真实完整地反映结合在,DNA,序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。,概述,原理,方法,比较,举例,EMSACHIP由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合,10,应用举例,概述,原理,方法,比较,举例,Mantovani F,Tocco F,Girardini J,et al.The prolyl isomerase Pin1 orchestrates p53 acetylation and dissociation from the apoptosis inhibitor iASPP.Nat Struct Mol Biol.2007 Oct;14(10):912-920.,应用举例概述Mantovani F,Tocco F,Gi,11,概述,原理,方法,比较,举例,Saleh A,Alvarez-Venegas R,Avramova Z.An efficient chromatin immunoprecipitation(ChIP)protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants.Nat Protoc.2008;3(6):1018-1025.,概述Saleh A,Alvarez-Venegas R,12,扩展应用举例,CHIP-on-chip,概述,原理,方法,比较,举例,扩展应用举例CHIP-on-chip概述,13,Chi SW,Zang JB,Mele A,Darnell RB.Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.Nature.2009 Jul 23;460(7254):479-486.,概述,原理,方法,比较,举例,crosslinking immunoprecipitation,(CLIP),For,microRNAmRNA interaction,Ago-argonaute,蛋白,Chi SW,Zang JB,Mele A,Darne,14,谢 谢！,谢 谢！,15,