植物DNA分子标记课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物,DNA,分子标记,植物DNA 分子标记,1,分子标记的概念,广义的分子标记,（,molecular marker,）：可遗传的并可检测的,DNA,序列或蛋白。包括蛋白质标记和,DNA,标记（狭义的分子标记）。,蛋白质标记包括动,植物蛋白,、,同工酶,及,等位酶,分子标记的概念,2,理想的分子标记：,1.,高多态性,2.,共显性遗传*,3.,能明确辨别等位基因,4.,遍布整个基因组,5.,无基因多效性 *,6.,检测手段简单快速,7.,成本低廉,8.,重复性好,*杂合子的一对等位基因各自都具有自己的表型效应，称为共显性（,codominance,）,*,基因多效性（,gene pleiotropism,）,：一个基因产生多种表型效应的现象。,理想的分子标记：,3,DNA,分子标记（,DNA molecular marker,）直接在,DNA,分子水平上检测生物间的差异，是,DNA,水平上遗传变异的直接反应。,随着分子生物学技术的发展，现在,DNA,分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。,DNA,分子标记大多以电泳谱带的形式表现，分为,非,PCR,依赖的分子标记,(,基于,Southern,杂交技术的分子标记,),和,PCR,依赖的分子标记,。,植物DNA分子标记课件,4,非,PCR,依赖的分子标记,(,基于,Southern,杂交技术的分子标记,),包括：,限制性片段长度多态性标记,（,restriction fragment length polymorphism,RFLP,）,原位杂交（,in situ,hybridization,）,非PCR依赖的分子标记,5,PCR,依赖的分子标记：,随机扩增多态性,DNA,标记,（,random amplification polymorphism DNA,RAPD,）,DNA,扩增指纹印记,（,DNA amplification fingerprinting,DAF,）,简单序列重复标记,（,simple sequence repeat,SSR,）,随机引物聚合酶链式反应,（,arbitrarily primed PCR,AP-PCR,）,扩增片段长度多态性标记,（,amplified fragment length polymorphism,AFLP,）,PCR依赖的分子标记：,6,基于分子杂交技术的分子标记技术,此类标记技术是利用,限制性内切酶解,及,凝胶电泳,分离不同的生物,DNA,分子，然后用经标记的,特异,DNA,探针,与之进行杂交，通过,放射自显影,或,非同位素显色,技术来揭示,DNA,的多态性。,分子杂交,：由具有互补碱基顺序的任何两条,单链,核酸分子片断形成,双链,的过程。,基于分子杂交技术的分子标记技术,7,染色体原位杂交,是指,DNA,探针与染色体上的,DNA,杂交，并在染色体上直接进行检测的分子技术，其原理是两条核苷酸,单链片断,在适宜的条件下，通过,氢键,结合，形成,DNA-DNA,，,DNA-RNA,，,RNA-RNA,双键分子，用带有标记的,DNA,或者,RNA,片断作为核酸探针，与细胞内染色体杂交，用放射自显影等方法予以显示，在荧光显微镜下观察目的,mRNA,或者,DNA,的存在与定位。,染色体原位杂交,8,In situ hybridization,For,in situ,hybridization,a tissue sample is incubated with a labeled nucleic acid probe,excess probe is washed away and the location of hybridized probe is examined.,The technique enables the spatial localization of gene expression to be determined as well as the location of individual genes on chromosomes.,In situ hybridization,9,植物DNA分子标记课件,10,b,c,d,a,Fig.5,GISH images of chromosomes of tetraploid and diploid,Festulolium,progenies,.,The DNA of,L.perenne,was used as probe,and shown as blue color.The chromosomes of,F.pratensis,were shown as pale blue color.Translocation breakpoints are indicated in a and c by arrows.,(a),Bx350-184,a 28-chromosome genome with at least 14 intergeneric translocations,some of which have two breakpoints in an arm(arrows).Bar:10,m.,(b),Bx351-160,a 28-chromosome genome with intergeneric translocations.Bar:20,m.,(c),Bx350-177 with fertile pollen,a 28-chromosome genome comprising approximately equal amount of,Lolium,and,Festuca,DNA with 9 intergeneric translocations,some of which have two breakpoints in an arm(arrows).Bar:20,m.,(d,),Prior-57,a 14-chromosome genome with intergeneric translocations.Bar:10,m.,Guo et al.2005,bcdaGuo et al.2005,11,RFLP,标记：,限制性片段长度多态性,RFLP,指应用特定的,核酸内切酶,切割有关的,DNA,分子所产生的,DNA,片段在长度上的变化。,包括基因组,DNA,限制性酶切，,Southern,印记，,DNA,探针制备，同位素,/,非同位素标记，,DNA,分子杂交等步骤。,RFLP标记：限制性片段长度多态性,12,生物能快速、精确地复制自身的,DNA,，但这种精确性是相对的。实际上，在植物的自然群体中存在大量的,DNA,序列变异。如：碱基对的代换、缺失等。几乎不可能有两个生物体,DNA,的碱基序列是相同的。,限制性内切酶酶解,DNA,长链，是识别,DNA,上的特异的位点并在这些位点上切断的过程。酶识别位点碱基对,越少,，,DNA,分子中被识别的位点,越多,，所产生的限制片段,越短,。,13,来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源,DNA,分子，都会在同样的位点被准确切割。但是在不同物种、不同品种、甚至同一品种的不同的两个个体之间，,DNA,会发生变异，其中有些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了,限制片段长度,的,多态性,。,来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源DNA分子，都会,14,用限制性酶来酶解植物核,DNA,会产生数万个片段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。,进行,Southern,印迹转移操作，用特定的探针与滤膜上的,DNA,杂交，经过,放射自显影,就能检测到高等植物核,DNA,的,RFLP,。,用限制性酶来酶解植物核DNA会产生数万个片段，其大小变,15,0.1kb,0.2kb,0.4kb,0.5kb,(1),0.3kb,0.4kb,0.5kb,(2),0.2kb,0.3kb,0.5kb,品系,1,品系,2,0.4kb,0.1kb,+,0.1kb0.2kb0.4kb0.5kb(1)0.3kb0.,16,RFLP,标记方法与步骤,（,1,）,DNA,的分离：可用,CTAB,法或,SDS,法,（,2,）酶切：一般根据基因组总,DNA,的复杂性选 用限制酶。,（,3,）琼脂糖凝胶电泳,（,4,）,Southern,印迹转移,（,5,）,DNA,杂交及放射自显影,RFLP标记方法与步骤,17,RFLP,标记优点,（,1,）不受性别、年龄局限，不会受表达的组 织、发育阶段或外界环境的不同而受影,（,2,）标记座位的等位基因间是,共显性,的，通过 杂交后电泳带型可直接区别杂合子和显性 纯合子,（,3,）,RFLP,标记源于基因组,DNA,自身变异，在 数量上几乎不受限制。,RFLP标记优点,18,RFLP,标记缺点,（,1,）,DNA,需要量大。,（,2,）所需仪器较多,（,3,）技术较为复杂,（,4,）多数,RFLP,表现为二态性，提供的信息量较低,（,5,）与内切酶选用密切相关,RFLP标记缺点,19,RAPD,标记,1990,年，,美国杜邦公司,科学家,Williams,推出。,RAPD,方法是在,PCR,技术基础上发展起来的，它利用一系列单个随机引物（通常为,10,个核苷酸），对所研究的基因组,DNA,进行,PCR,扩增，引物与基因组,DNA,某一区段互补时，就与其结合，就可对引物下游,DNA,进行合成，即扩增。,RAPD标记,20,RAPD,的基本概念和原理,RAPD,的引物：,（,1,）为随机引物,（,2,）序列较短（通常为,10,个核苷酸）,（,3,）为一个寡核苷酸单链引物,RAPD的基本概念和原理,21,0.2kb,0.5kb,0.3kb,0.2kb,0.5kb,0.3kb,0.2kb,0.3kb,0.5kb,品系,1,品系,2,0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb,22,RAPD,的基本实验程序,1.DNA,的提取,2.,模板,DNA,浓度和质量的检测,3.PCR,扩增,4.,电泳检测：,PCR,结束后每个样品加,4ul,凝胶上样缓冲液，每个泳道点样,20ul,。,5.,将凝胶浸于,1ug/ml,的,EB,中,30min60min,，用水清洗约,10min,，观察、拍照。,6.,统计分析：记录条带清晰的,RAPD,条带，计算带纹相似率；计算带频率、群内遗传纯度；,DNA,片段大小。,RAPD的基本实验程序,23,RAPD,结果,Timothy genetic variation(Guo et al.2002),RAPD结果Timothy genetic variat,24,RAPD,的优缺点,优点：,（,1,）不需,DNA,探针，设计引物不需知道序列信息。覆盖整个基因组。具有广泛适用性和通用性。,（,2,）用一个引物可扩增出多片段。,（,3,）技术简单，需要样品量少，成本低。,（,4,）每个,RAPD,标记相当于基因组分析中的靶序列位点，简化信息的转移过程。,（,5,）可以对,RFLP,难以分析的基因组区域做遗传连锁图。,（,6,）分析自动化。,RAPD的优缺点,25,RAPD,的优缺点,缺点：,（,1,）显性标记，无法区别显性纯合体和杂合体。,（,2,）对反应条件敏感，重复性差。模板浓度、,Mg,2+,浓度，,PCR,反应中条件的变化等。,（,3,）存在共迁移问题。不同个体相同分子量的片段 不一定同源；一条带可能包含不同的产物。,RAPD的优缺点,26,AFLP,标记,AFLP,：扩增片段长度多态性,（,amplified fragment length polymorphism,）,AFLP,技术是,1992,年由荷兰,Keygene,公司的科学家,Zabe