单核增生李斯特氏菌检测概述

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,内容,简介李斯特氏菌属,单核增生李斯特氏菌生物学特性,流行病学,致病性,实验室危害及其预防,检测程序,快速检测方法,第,1,页,/,共,44,页,李斯特氏菌属,李斯特氏菌属（,Listeria,）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个种：,单核增生李斯特氏菌（,Listeria monocytogenes,）,伊氏李斯特氏菌（,Listeria ivanovii,）,无害李斯特氏菌（,Listeria innocua,）,斯氏李斯特氏菌（,Listeria seeligeri,）,威氏李斯特氏菌（,Listeria welshimeri,）,格氏李斯特氏菌（,Listeria grayi,）,在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：,单核增生李斯特氏菌,和,伊氏李斯特氏菌,可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（,listeriosis,）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。,第,2,页,/,共,44,页,生物学特性,-,菌体形态及染色特征,革兰氏,阳性,；,小的、类似球形,杆菌,，,0.4,0.50.52,m,，,在有些培养基中稍弯，两端钝圆，单个、成短链、细胞彼此连成,V,形，或成群的细胞沿长轴方向平行排列，在较老的或生长不良的培养物中，可能形成丝状；,20-25,以,4,根周生,鞭毛,运动，在,37,只有较少的鞭毛或,1,根鞭毛；,无芽孢、无荚膜。,第,3,页,/,共,44,页,第,4,页,/,共,44,页,生物学特性,-,培养特性,兼性厌氧；,在,20-25,培养有,动力,，穿刺培养,2-5,天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。,生长温度范围为,2-42,（也有报道在,0,能缓慢生长），最适培养温度为,35-37,。,pH,范围,pH4.4-pH9.6,。,第,5,页,/,共,44,页,生物学特性,-,培养特性,在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。,在,5-7%,的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的,-,溶血环,。,在,0.6%,酵母浸膏胰酪大豆琼脂,(TSAYE),琼脂上，用,45,角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。,第,6,页,/,共,44,页,生物学特性,-,生化反应,触酶,阳性，,氧化酶,阴性。,能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、,鼠李糖,、,七叶苷,、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵,木糖,、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。,不利用枸橼酸盐，,40%,胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，,VP,、甲基红试验和精氨酸水解阳性。,第,7,页,/,共,44,页,生物学特性,-,血清型,根据菌体（,O,）抗原和鞭毛,(H),抗原，将单增李氏菌分成,13,个血清型，分别是,1/2a,、,1/2b,、,1/2c,、,3a,、,3b,、,3c,、,4a,、,4b,、,4ab,、,4c,、,4d,、,4e,和,“,7,”,。,致病菌株的血清型一般为,1/2b,、,1/2c,、,3a,、,3b,、,3c,、,4a,、,1/2a,和,4b,后两型尤多。,第,8,页,/,共,44,页,生物学特性,-,抵抗力,该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；,对碱和盐抵抗力强，,60-70,经,5-20min,可杀死，,70%,酒精,5min,、,2.5%,石炭酸、,2.5%,氢氧化钠、,2.5%,福尔马林,20min,可杀死此菌；,湿热灭菌（,121,，至少,15min,）和干热灭菌（,160-170,，至少,1hr,）可杀灭该菌，对紫外线和,射线敏感,；,该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素（已产生抗性）、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。,第,9,页,/,共,44,页,流行病学,分布,：广泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、废水、青储饲料、动植物及其食品中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔,-,粪便的途径进行传播,寄主范围,：哺乳动物、鸟类、鱼类、甲壳类和昆虫,第,10,页,/,共,44,页,流行病学,据报道，有,1-10%,的人类肠道中存在单核增生李斯特氏菌，,4-8%,的水产品、,5-10%,的奶及其产品、,30%,以上的肉制品及,15%,以上的家禽均被该菌污染。,相关食品,：鲜奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是软奶酪）、冰激凌、生的蔬菜、发酵过的生肉制作的香肠、生的和加工过的禽肉、各种生的肉类、生的和烟熏的鱼肉。约有,85-90%,的病例是由被污染的食品引起的。,第,11,页,/,共,44,页,1996,年至,1999,年，因单核增生李斯特氏菌回收的食品种类（来源：,USDA,及,FDA,报告）,第,12,页,/,共,44,页,致病性及其治疗,该病的临床表现，健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、,自然流产或死婴,、脑膜炎、败血症直至死亡。,由该菌造成的脑膜炎的致死率可高达,70%,，败血症的死亡率达,50%,，围产期或新生儿感染的死亡率超过,80%,，怀孕期妇女的感染，母亲通常能存活下来。,抗生素治疗，用青霉素或氨苄青霉素注射给药，或与氨基糖苷类抗生素一起用药。,第,13,页,/,共,44,页,感染人群,感染剂量未知，但与该菌的毒力和易感人群的年龄、免疫状态有关。,易感者：,孕妇,/,胎儿,围产期和新生儿的感染；,接受皮质激素、抗癌剂治疗、器官移植 治疗、艾滋病患者等免疫缺损者；,癌症病人,尤其是白血病的患者；,不太常见的报道,糖尿病、肝硬化、哮喘和溃疡性结肠炎的患者；,年纪较大的人；,没有免疫缺陷的健康的人，食用污染该菌尤其是大量污染该菌的食品后，也有患病的危险。,第,14,页,/,共,44,页,致病机理,单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下：,1,、寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；,2,、抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解；,3,、,溶血素,，即李氏杆菌素,O,，可以从培养物上清液中获得，有,和,两种，为毒力因子。,第,15,页,/,共,44,页,实验室危害,不是一种普遍的与实验室相关的传染病，目前只有少数有报道的案例发生；,直接摄取,是最普遍的一种感染方式，除此之外，暴露在该菌高浓度的气溶胶中，也可通过眼睛和破损的皮肤、粘膜进入体内造成感染。,第,16,页,/,共,44,页,注意事项,生物安全,2,级,，操作时应有相应的防污染设施，在进行可能产生气溶胶的操作时，应在生物安全柜内完成；,在直接接触有感染性的材料时，必须穿着实验服，戴手套和护目镜；,怀孕的妇女,应避免接触传染物。,第,17,页,/,共,44,页,操作要求,溅洒,：使气溶胶沉降，穿着防护服装，用纸巾轻轻覆盖溅洒处，加入,1%,次氯酸钠溶液，由周边向中心加，在清理之前要留充足的接触时间（,30min,）；,废弃,：在废弃前应先采取净化措施，高压蒸汽灭菌、化学消毒、焚烧等；,储存,：在有适当标记的密封容器内储存。,第,18,页,/,共,44,页,检测程序,-,增菌,目前常用的单核增生李斯特氏菌检测增菌肉汤主要有,半量,Fraser,肉汤,、,Fraser,肉汤,（,FB,）、,UVM,（,Modified University of Vermont broth,，也叫,UVM1,）、,LEB,（,Listeria,enrichment broth,）和,BLEB,（,buffered,Listeria,enrichment broth,）,第,19,页,/,共,44,页,半量,Fraser,肉汤和,Fraser,肉汤,具有,选择性,和,区别性,。,加入,柠檬酸铁铵,和,七叶灵,，起到区别的作用。李斯特氏菌可以水解七叶灵，与培养基中的铁离子反应，使培养基变黑，可直观的从培养液的颜色就可以判断是否有单核李斯特氏菌的生长。,氯化锂,、,吖啶黄,和,萘啶酮酸,作为选择性因子。,半量,Fraser,肉汤与,Fraser,肉汤所用的添加剂一样,半量,Fraser,肉汤：萘啶酮酸,10mg/L,，吖啶黄,12.5mg/L,Fraser,肉汤：萘啶酮酸,20mg/L,，吖啶黄的,25mg/L,第,20,页,/,共,44,页,UVM,UVM,只有选择性没有区别性,加入,萘啶酮酸,和,盐酸吖啶黄,，作为选择性因子。虽然其中含有七叶灵，但是没有添加柠檬酸铁铵，不能发生黑色的颜色反应。,第,21,页,/,共,44,页,LEB,和,BLEB,只有选择性没有区别性,LEB,是在,TSB-YE,的基础上加入,盐酸吖啶黄,、,萘啶酮酸,和,放线菌酮,等选择性因子；加入的,丙酮酸钠,，有助于受损细胞的恢复；不含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应,BLEB,是在,LEB,基础上加入缓冲体系：磷酸二氢钾和磷酸氢二钠,第,22,页,/,共,44,页,检测程序,-,分离,分离培养基有：,OXA,、,PALCOM,、,LPM,、,MOX,等，但首选仍然是,OXA,。分离原理主要是基于李斯特氏菌具有,D,葡萄糖苷酶,的活性，能水解培养基中的七叶灵，产生七叶苷，与铁离子产生颜色反应而，使菌落为棕褐色，并带有褐色晕圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能发生这种反应,还有一些选择性显色培养基，如,BCM,、,ALOA,、,CHROMagar listeria,、,Rapid,L.mono,等，其原理主要是检测由毒力基因编码的,溶血素,，而此种溶血素只存在于单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而可以很好的将此两种菌同李斯特属的其他种分开。,第,23,页,/,共,44,页,OXA,平板,单核增生李斯特氏菌,ATCC 19117,48h,，,35,培养,第,24,页,/,共,44,页,OXA,平板,无害李斯特氏菌,ATCC 33090,48h,，,35,培养,第,25,页,/,共,44,页,检测程序,-,鉴定,蓝色菌落检验（,Henry illumination,）,典型运动：相差显微镜，轻微旋转或翻跟头,动力试验：,7,天，伞形生长,过氧化氢酶,试验：阳性,革兰氏染色,：阳性短杆菌,溶血试验,：穿刺接种血平板,硝酸盐还原试验：,5,天，阴性,糖发酵试验,：葡萄糖、麦芽糖和七叶灵，李斯特菌属反应均为阳性，除格氏李斯特甘露醇阴性，李斯特其他种甘露醇阴性，,木糖,和,鼠李糖,最有检测意义,第,26,页,/,共,44,页,动力试验,第,27,页,/,共,44,页,血平板,单核增生李斯特氏菌,ATCC 19117,36h,，,35,培养,第,28,页,/,共,44,页,血平板,无害李斯特氏菌,ATCC 33090,36h,，,35,培养,第,29,页,/,共,44,页,血平板,伊氏李斯特氏菌,ATCC 19119,24h,，,35,培养,第,30,页,/,共,44,页,单核增生李斯特氏菌检测流程,25g,样品,+225ml BLEB,基础（加入丙酮酸钠）,加入萘啶酮酸、盐酸吖锭黄、放线菌酮,30,4hr,划线接种,OXA,平板,30,24hr,和,48hr,科玛嘉李氏菌显色培养基,TSA-YE,分纯,35,24hr-48hr,35,24hr,过氧化氢酶试验、革兰氏染色、溶血试验、糖发酵试验（木糖、鼠李糖）,API Listeria,35,24-48hr,报告结果,35,18-,24hr,第,31,页,/,共,44,页,方法名称,一次增菌,二次增菌,分离,鉴定,快速方法,SN 0184,-1993,加工,MBP,30,，,18-24h,EB,30,，,24/48h,MMA/,OX