第10章--酶动力学课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1903 Henri,enzyme,sucrose +H,2,O,glucose +fructose,一、底物浓度对酶促反应速度的影响,（单底物酶促反应）,（一）中间复合物学说,1903 Henri,中间复合物学说认为酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。,中间复合物学说证据：p152,SE ES PE,1903年，,Henri,以蔗糖酶研究底物浓度与反 应速率的关系，,提出了酶与底物作用的“,中间复合物学说,”。,中间复合物学说认为酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物,（二）,“稳态理论”,Briggs和Haldane 1925,稳态理论的贡献在于：,ES的动态平衡不仅与 E+S,ES有关，还与ES,P+E有关。,所谓,“,稳态,”,：,ES的,形成速度,与,分解速度,相等、,ES的浓度保持不 变的反应状态,稳态理论的贡献在于：ES的动态平衡不仅与 E+S,米氏常数：,当,K,m,及,V,max,已知时，根据米氏方程可确定酶反应速度与底物浓度的关系。,米氏方程：,（三）用稳态理论推导米氏方程,米氏常数：当Km及Vmax已知时，根据米氏方程可确定酶反应速,1.当S K,m,时,:,3.当S=K,m,时,:,根据米氏方程可以说明以下关系：,1.当S Km时:3.当,1.当S K,m,时,:,3.当S=K,m,时,:,根据米氏方程可以说明以下关系：,即K,m,是当酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，单位：,molL,-1,或,mmolL,-1,。,复 习,1.当S Km时:3.当,1、K,m,的物理意义,当反应速度,v=1/2 V,max,时，,K,m,=S，,K,m,的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时的底物的浓度。单位：,molL,-1,或,mmolL,-1,。,K,m,是酶的特征常数之一，一般只与酶的种类、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。因此，在特定条件下测定酶的,K,m,值，可以作为鉴别酶的一种手段。,一些酶的K,m,值（见表,10-1）。,（四）米氏方程中各参数的意义,1、Km的物理意义（四）米氏方程中各参数的意义,有的酶可作用于几种底物，因而就有几个,K,m,值，其中K,m,最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为：,K,m,愈小（达到,V,max,一半所需的底物浓度愈小）,表示V对S 越灵敏。,1,2,2、K,m,可以判断酶专一性和天然底物,V,S,1/2V,max,K,m2,K,m1,有的酶可作用于几种底物，因而就有几个Km 值，其中Km最小的,3、K,m,与底物亲和力,K,m,是,ES分解速度（K,2,+K,3,）与形成速度（,K,1,）的比值。,K,m值近似表示酶与底物之间的亲和程度：,K,m值愈大，表示亲和程度愈小。,第10章-酶动力学课件,4、K,m,与米式方程的实际用途,如当,S3,K,m,时,（,1）根据S求V,V0.75 V,max,如当S3Km时（1）根据S求VV0.75 Vma,（,2）根据相对速度推测酶活性中心饱和度Y：,当,v=V,max,时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，,v与S无关，只和E,0,成正比。,当v=1/2 V,max,时，表示酶活性部位有一半被底物占据。,（2）根据相对速度推测酶活性中心饱和度Y：当v=Vmax时，,5、,K,cat,的意义：催化常数或,转换数,K,cat,是指当酶被底物充分饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数（称为,转换数,或催化常数），表示酶的最大催化活力的量度。,一些酶的转换数见表10-2。,5、Kcat的意义：催化常数或转换数 一些酶的转换数见,（五）,Km和Vmax的,求解方法,Lineweaver-Burk 双倒数作图法（最常用）,1/V,max,-1/K,m,1/S,1/V,斜率,=K,m,/V,max,（五）Km和Vmax的求解方法1/Vmax-1/Km1/,（一）酶的最适,pH,最适,pH：使酶促反应速度达到最大时的pH称为该酶的最适pH,。,最适,pH与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。,虽然大部分酶的,pH酶活曲线是钟罩形，但也有半钟形甚至直线形。,二、,pH对酶促反应速度的,影响,（一）酶的最适pH虽然大部分酶的pH酶活曲线是钟罩形，但也,（二）,pH影响酶活力的原因,过酸或过碱会影响酶蛋白构象，使酶活性丧失。,影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响,ES形成。,影响酶分子中一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。,（二）pH影响酶活力的原因,三、温度对酶促反应速度的影响,（一）最适温度及影响因素,最适温度：,温度对酶促反应速度的影响有两个方面：,1.温度升高，加快反应速度。2.温度升高，酶变性失活。,最适温度不是酶的特征常数，它与底物种类、作用时间、pH、离子强度 等因素有关。,温血动物酶的最适温度3540；植物酶最适温度4050；微生物差别大，如细菌Taq DNA聚合酶70。,温度系数Q,10,：温度升高,10，反应速度与原来的反应速度之比，大多数酶的Q,10,一般为,12。,三、温度对酶促反应速度的影响（一）最适温度及影响因素,第10章-酶动力学课件,四、激活剂对酶促反应速度的影响,（一）无机离子的激活作用,无机离子：,1.金属离子：K,+,、,Na,+,、,Mg,2+,、,Zn,2+,、,Fe,2+,、,Ca,2+,等；,2.无机阴离子：Cl,、,Br,、,PO,4,3,等；,特点：,1.激活剂的选择性，即不同的离子激活不同的酶。,2.不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na,+,与,K,+,、,Mg,2,与,Ca,2,之间常常拮抗，但,Mg,2,与,Zn,2+,常可替代。,3.激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，150mM,激活剂：凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。包括无机离子或简单有机化合物。,许多金属离子是酶的辅助因子，是酶的组成成分，参与催化反应中的电子传递。,有些金属离子可与酶分子肽链上侧链基团结合，稳定酶分子的活性构象。,有的金属离子通过生成螯合物，在酶与底物结合中起桥梁作用。,四、激活剂对酶促反应速度的影响（一）无机离子的激活作用,（二）小分子有机物的激活作用,1.某些激活剂（如Cys、GSH）能还原巯基酶中的某些二硫键使成-SH，-SH是巯基酶起催化作用所需的基团，提高了酶活性。,2.金属螯合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)，可络合一些重金属离子，解除它们对酶的抑制，从而使酶活升高。,（二）小分子有机物的激活作用,五、抑制剂对酶促反应速度的影响,失活,(inactivation)：,凡是酶活力的降低或丧失都称为酶的失活。,抑制,(inhibition)：,使酶活力下降或丧失但并不引起酶蛋白变性，它主要改变酶活性中心的化学性质。,抑制剂（,inhibitor）：,引起酶的抑制作用的物质称为酶的抑制剂。,五、抑制剂对酶促反应速度的影响失活(inactivat,研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：,（,1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发；抗癌药,（2）了解生物体的代谢途径，进行人为调控或代谢控制发酵；,（3）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础。,研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：,（一）抑制程度的两种表示方法,1、相对活力,2、抑制分数,（一）抑制程度的两种表示方法,（二）抑制作用的类型,1、不可逆的抑制作用:,抑制剂与酶的必需基团,共价结合,，使酶的活性丧失，无法用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。,S +E,ES,E+P,+,I,EI,（二）抑制作用的类型 抑制剂与酶的必需基团共价结合，,2、可逆的抑制作用:,抑制剂与酶以,非共价键结合,引起酶活力降低或丧失，可以用透折、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。,根据可逆抑制剂与底物的关系分为：,（1）竞争性抑制,（2）非竞争性抑制,（3）反竞争性抑制,抑制程度,是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定,。,抑制剂与酶以非共价键结合引起酶活力降低或丧失，可以,（,1）竞争性抑制（Competitive inhibition）,酶活性部位是不能同时结合底物与抑制剂的。抑制剂具有与,底物相似的化学结构,，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的,EI复合物，阻止底物与酶结合；可以通过增加底物浓度(即提高底物的竞争能力）而解除此种抑制。,第10章-酶动力学课件,例如，丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。,琥珀酸,丙二酸,例如，丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。琥珀酸丙二酸,（,2）非竞争性抑制,（,noncompetitive inhibition）,底物和抑制剂可以,同时与酶结合,，但是，中间的三元复合物,ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低；抑制剂与酶活性中心以外的基团结合，其结构与底物无共同之处；不能用增加底物浓度的办法来消除非竞争性抑制作用。,例如；某些重金属离子,（,Cu,2+,、,Hg,2+,、,Pb,2+,）对酶的抑制属于非竞争性抑制。,第10章-酶动力学课件,酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。,E+SES+I ESI,常见于多底物的酶促反应中。,（,3）反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）,（3）反竞争性抑制（uncompetitive inhib,（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别,1、看通过透析、超滤、凝胶过滤等方法能否除去抑制剂；,2、通过v E动力学曲线区分。,2,1,3,E,v,不可逆与可逆,曲线,1：无抑制剂,曲线2：不可逆抑制剂,曲线3：可逆抑制剂,（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别213Ev不可,（四）可逆抑制作用的动力学,推出三种抑制方程：,（,1）竞争性抑制,（2）非竞争性抑制,（3）反竞争性抑制,（四）可逆抑制作用的动力学,V,max,不变；,K,m,变大，而且随,I浓度的增大而增大,动力学方程：,（,Ki为EI的解离常数）,1、竞争性抑制,：,交于,y轴,Vmax不变；Km变大，而且随I浓度的增大而增大动力学,2、,非竞争性抑制,动力学方程：,交于,x轴,K,m,不变，,V,max,降至,V,max,/（1+I/K,i,）,动力学方程：交于x轴Km不变，Vmax降至Vmax/（1,3、,反竞争性抑制,K,m,及,V,max,都变小,动力学方程：,一组平行直线,Km及Vmax都变小动力学方程：一组平行直线,有无抑制剂时酶促反应的最大速度与,Km值的比较,类型 方程式,V,max,K,m,反竞争性抑制,非竞争性抑制,竞争性抑制,无抑制剂,V,max,K,m,不变,增加,减小,不变,减小,减小,总 结,有无抑制剂时酶促反应的最大速度与Km值的比较 类型,（五）一些重要的抑制剂,（五）一些重要的抑制剂,1、不可逆抑制剂,有机磷化合物,有机磷化合物的化学结构式,P,Y,O,X,R,R,O,Y,为氧或硫。含氧的为磷酸酯类，含硫的为硫代磷酸基类。目前含硫的硫代磷酸酯类农药由于属剧毒类，现多已停止生产。市场上农药多为磷酸酯类。,PYOXRROY为氧或硫。含氧的为磷酸酯类，含硫的为硫代磷,有机磷农药呈油状或结晶状，淡黄至棕色，稍有挥发性。,较易通过皮肤和黏膜、呼吸道及消化道吸收。,在中毒死亡者中，因服有机磷农药中毒致死者占83.6%。,第10章-酶动力学课件,病 因,使用性中毒,生活性中毒,生产性中毒,病 因使用性中毒生活性中毒生产性中毒,有机磷化合物,能与乙酰胆碱酯酶的活性部位,的,SerOH,形成磷酯键，强烈地抑制酶的活力，使乙酰胆碱不能够被分解而过分积累，导致神经系统过于兴奋，引起神经系统功能失调而中毒致死。,乙酰胆碱酯酶,磷酰化胆碱酯酶,有机磷杀虫药,中毒机制：有机磷农