生物技术制药概论蓝有稳

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章、药物生物技术新进展,第二节、转基因技术制药,一、现代生物技术的定义与主要内容,生物技术,(Biotechnology or Bioengineering,）,:,对生物,有机体,（微生物至高等动、植物）或其,组成部分,（器官、组织、细胞或细胞器等），运用分子生物学、细胞生物学、生物化学、生物物理学、生物信息学等手段，研究、设计、改造，以,改良生物,乃至,创造新的生物品种,的一种技术体系。,转基因是指遗传物质在生殖细胞间夸物种的转移。,转基因技术分为植物转基因技术和动物转基因技术。,一、生物药物,(biopharmaceutics),一、概念,利用,生物体及其成分,综合利用生物学、生物化学、微生物学、生物组织免疫学、物理化学、药学原理、方法加工制造的,预防,诊断疾病的制品,治疗,二、未来医药卫生领域中的生物技术展望,转基因动物生产的“转基因药物”,1978,年 把人,tPA,基因转入小鼠受精卵发育成转基因小鼠并证明在其乳汁中能得到,tPA,美国,DNx,公司的“制药工厂”转基因猪,环球基因药物公司 转基因奶牛,基因酶公司,转基因山羊,英国药物蛋白公司,转基因绵羊,“转基因药物”与基因工程药物相比,产量高，成本低,具有与人体自身产生的蛋白相同的生物学活性。乳腺细胞能进行一系列的翻译后修饰作用，包括糖基化作用等，正确地产生人体蛋白。,2.,人型,McAb(monoclonal antibody),的制备,技术路线：,鼠型,McAb,分子中更换一段人抗体分子中与抗原结合的链段（用蛋白质工程的方法）；,从人鼠杂交瘤细胞中直接克隆人抗体基因，并使之在细菌中得到表达；,将人免疫球蛋白重链,C,区基因转入小鼠受精卵，发育成转基因小鼠，用特定抗原免疫得人型化,McAb,。,3.,基因治疗 “基因打靶”技术,将外源基因定点整合到细胞基因组的某一确定位点上，因而能对缺陷基因进行原位修复。,转基因植物制药,主要内容,1 转基因植物疫苗的概念及其发展历史,2 利用转基因植物生产疫苗的原理及基本方法,3 转基因植物疫苗种类及应用,4 转基因植物疫苗的优点,5 转基因研究中的问题及解决办法,6 展望,1,转基因植物疫苗的概念及其发展历史,转基因植物疫苗,：,利用基因工程技术,，,将,病原微生物的抗原编码基因,进行克隆重组,导入植物细胞生成转基因植物,进而表达产物，它能激发粘膜免疫,使机体产生特异性抗病能力,。,发展史,1989,，,Hiat,首次在,Nature,发表了转基因植物疫苗的研究；,1990,年,Curtiss,等人在烟草种子中表达了具抗原性的变异链球菌表面蛋白获得成功。,1992,年,ason,等人在烟草中又表达了乙肝表面抗原,(,BsAg,),;,至今，有,70,多篇研究论文发表，有的进入临床阶段。,世 界 第 一 种 口 服 植 物 疫 苗,2植物疫苗基本原理及方法,原理：转基因植物疫苗或植物疫苗是把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合,生产出能使机体获得特异性抗病能力的疫苗。,动物试验已证实,转基因植物表达的抗原蛋白经纯化后仍保留了免疫学活性,注入动物体内则能产生特异性抗体。,2.1利用植物生产疫苗的程序,2.1利用植物生产疫苗的程序,疫苗目的基因的克隆;,高效植物,表达载体系统,的构建;,植物细胞的遗传转化;,受体细胞的组织培养及植株再生;,抗性植株的筛选和分子鉴定;,转化植株栽培及种植;,目标产品的提取、分离和纯化及免疫学实验等。,2.2 主要表达系统,(1)稳定的整合表达系统：,一般以根癌农杆菌环状,Ti,质粒上的,DNA,片断为载体,把编码结构性抗原决定簇参与诱导保护性免疫应答的病原体,DNA,序列导入植物细胞内,并整合到染色体上,整合了外源基因的植物细胞在一定的条件下长成新植株,这些植株在生长过程中可表达出疫苗,并把这些性状遗传给子代,形成,表达疫苗的植物品系,。,(2)瞬时表达系统：,主要是利用基因工程植物病毒(如烟草花叶病毒、豇豆花叶病毒)为载体,将编码疫苗抗原决定簇基因序列插入,植物病毒基因组,中,再用此重组病毒感染植物,抗原基因随病毒在植物体内复制、装配而得以高效表达。,利用稳定表达系统的优点,1 能够获得大量稳定遗传的转基因株系；,2 获得的转基因植株可以通过无性或有性繁殖方式获得大量后代；,3 可以选择外源抗原的表达器官,调节外源蛋白的组织特异性,有利于蛋白纯化；,4 可以同时将多个外源基因与植物基因组重组,从而获得多基因复合疫苗产品。,利用植物病毒作为表达载体优点,1 病毒增殖水平较高,可使外源基因有高水 平表达;,2 病毒繁殖速度快,外源基因在接种后12周内就可达到最大量的积累;,3 植物病毒的基因组小,易于进行遗传操作;,4 植物病毒可以感染单子叶等非农杆菌寄生植物,扩大了适用植物的范围。,3 转基因植物疫苗种类及应用,1990年,在转基因烟草中用农杆菌介导转化法表达出约占烟草蛋白0.02%的变异链球菌表面蛋白(,spaA);,Mason(1992),提出了利用转基因植物生产可食用疫苗的概念,;,在短短10年左右的时间里,已经有十几种病毒或细菌的抗原基因在转基因植物中获得表达,且基本保留了其天然免疫原性。,报道的植物疫苗主要种类,(1)细菌疫苗:,主要有大肠杆菌热不稳定毒素,B,亚单位疫苗和霍乱毒素,B,亚单位疫苗。,(2)病毒疫苗:,目前研制出的病毒疫苗有乙型肝炎疫苗、免出血症病毒疫苗、口蹄疫病毒疫苗、传染性胃肠炎冠状病毒疫苗、狂犬病病毒疫苗、诺沃克病毒疫苗、传染性胃肠炎病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗等。,(3)寄生虫疫苗:,李霞等将疟原虫多表位抗原(,AWTE),基因与,CT-B,基因融合构建植物表达载体转化烟草,经,PCR,检验证实成功,经,Westernblotting,等分析表明特异表达的融合蛋白是,CT-B,和,AWTE,基因的结合,具有二者的抗原活性。,(4)避孕疫苗:,哺乳动物受精过程中精卵结合是具有种属特异性的,这种特异性是由精子表面的特异蛋白与卵细胞透明带,ZP3,糖蛋白通过受体配体模式进行的。,Fitchen,等将小鼠,ZP3,蛋白的一个抗原决定簇融合表达在,TMV,的衣壳蛋白中,在感染的植物中产生高水平的融合蛋白,用该蛋白免疫小鼠,小鼠体内产生了抗,ZP3,的特异性血清抗体,能识别,ZP3,的合成肽。,4 转基因植物疫苗的优点,成本低廉,；,疫苗易于口服，,安全,方便；,口服疫苗比传统疫苗更,有效,；,它能对真核蛋白质进行,准确,的翻译后加工修饰,使三维空间结构更趋于自然状态；,易于存储,和分发,无需冷藏设备,可长期随时供给。,传统疫苗,经典疫苗制备的基本过程包括：选择适宜的培养基或细胞进行茵、毒株大量繁殖，收集培养物，提纯，半成品捡定，稀释，分装，成品检定；,疫苗的基本成分包抗原、佐剂、防腐剂、稳定剂、灭活剂及其他活性成分。,传统疫苗的成份,5 转基因研究中的问题及解决办法,重组蛋白的表达问题（主要）,；,重组蛋白的转译后修饰及糖基化问题；,用于口服时易被消化及其作用机理问题；,表达产物的提取加工费用问题；,口服抗原疫苗免疫耐受方面的问题。,重组蛋白的表达问题,重组蛋白的表达量低,表达效率不稳定,在已报道的研究中,外源基因所表达的重组抗原蛋白,大约只占植物中可溶性蛋白的,0.01%,0.37%;,转基因沉默,由于外源基因的甲基化及基因共抑制等而使外源基因的表达不稳定,.,提高表达水平的一些方法,1 优化密码子的使用,；,2 启动子的选择,；,3 对目的基因进行改造与优化（使用植物偏爱密码子）；,4,特定调控序列的使用（增强子、内含子使用）；,5,消除位置效应（,应用核基质结合区以及定点整合技术,）；,6,外源蛋白的靶向表达（蛋白体、种子中的质体、叶绿体等）。,选择合适启动子,双子叶植物：35启动子；,单子叶植物：,Actin、,bi,启动子；,特异性启动子,种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。,复合式启动子,优化密码子,选择植物偏爱的密码子；,外源基因的含量和分布与宿主染色体尽量一致或接近,防止宿主识别系统对外源基因的甲基化。,6 展望,尽管利用转基因植物生产口服疫苗存在许多问题,其前景仍是十分美好的,;,对于世界上偏僻落后贫穷的国家和地区的人们、对动荡不安的发展中国家的人们以及发达国家的穷人们而言可以通过服用廉价的植物疫苗获得抵抗疾病的免疫力,;,可以肯定,利用转基因植物生产的食用疫苗将成为人类防治疾病的又一有力工具。,转基因动物制药,动物乳房生物反应器,主要内容,1,转基因动物制药的发展历史,2转基因动物,3转基因动物怎样生产药物,4转基因动物制药的优点,5抓住机遇，发展乳腺生物反应器产业,1,转基因动物制药的发展历史,20,世纪,70,年代后期，随着,DNA,重组技术的问世，诞生了基因工程药物或称基因药物。高产值、高效率的基因药物的出现给药物生产带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展,20,世纪,70,年代后期，随着,DNA,重组技术的问世，诞生了基因工程药物或称基因药物。高产值、高效率的基因药物的出现给药物生产带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展、极大地加速了基因工程药物的研制进程。在此之前，人们生产基因工程药物的方法，一是微生物基因工程，即把目的基因导入大肠杆菌等工程菌中，通过它表达目的基因蛋白，目前已上市的基因工程药物均采用这一方法；二是细胞基因工程，用哺乳动物细胞株表达目的产物，如生产凝血因子,。转基因动物则可将人们所需要的目的基因直接导入鼠、兔、羊、猪等动物体内，使目的基因在其体内表达，从而获得目的产品。转基因动物制药为当今最具发展前景的新药生产方式，兹将国内外近年的研究进展概述如下,2.1转基因动物,所谓转基因动物，就是用实验的方法将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵内，使外源基因与动物本身的基因,(,染色体,),整合到一起，前者就能随细胞的分裂而增殖，并在体内得到表达，稳定地遗传给后代。,1982,年世界第一只转基因动物“巨鼠”的产生，就是把大白鼠的生长激素基因导入小白鼠的受精卵里，将之再导入一“借腹怀孕”的母鼠体内，而生下一只比正常小鼠体格增长一倍的“巨鼠”。转基因动物与克隆动物截然不同。,1996,年英国的克隆绵羊“多利”，是把体细胞的核移植到一个去掉细胞核的卵细胞中，组装成一个类似受精卵的细胞，经无性生殖发育而成。转基因羊是将外源基因通过显微注射等方法导入羊受精卵的原核中，然后将之移植到母羊宫腔，让其发育成小羊。出生的小羊带有注射的外源基因，如注有人类凝血因子,基因者，子代小羊的乳汁中就有可能含有大量人凝血因子,蛋白，提取后即成治疗血友病的基因药物。克隆动物的意义在于突破了有性生殖的框架，证明了高等动物也可无性繁衍；转基因动物则重在它具有的经济价值，可以用来大量廉价地生产出珍贵的药物。,2.2转基因动物怎样生产药物,生物体对能量的利用和转化效率是当今任何机械装置都无法比拟的，因此通过转基因动物来生产药物是迄今最为先进、最有效的系统。动物的乳房是一天然的高效合成蛋白质的生物反应器，产生蛋白质的能力巨大。,20,世纪,80,年代中期，英国科学家克拉克首先在鼠的乳腺组织高效表达了人抗胰蛋白酶因子基因，开创了研制动物乳房生物反应器的先河。,1991,年又在绵羊乳腺中成功表达了这一基因，在这只名为“翠喜”的母羊初乳中，该药品的含量高达,35,克,/,升。在动物体内，细胞的分化需要发育基因来调节，这种调节是由多种蛋白质因子对增强区和启动区中成丛的顺式元件进行作用而实现的。用乳汁蛋白质基因的调节元件不仅可能使转基因的表达只限于乳腺组织，而且可能使转基因表达产物得到高水平的表达和大量生产。各种酪蛋白以及乳清蛋白和乳球蛋白等基因的调节元件已相继被克隆