免疫层析技术在乳品安全检测中的应用马立才博士2017年-食安中国

,免疫层析技术在乳品安全检测中的应用,马立才 博士,2023年08月 北京,主要内容,我国奶业进呈现状,乳品主要危害因素,免疫层析检测技术,胶体金免疫层析,荧光免疫层析技术,检测卡常见问题分析,一、我国奶业进呈现状,人均乳品消费量：,全球：107公斤；兴旺国家：200公斤；,我国：约30公斤；,全球乳品年产量：约8.02亿吨；,我国：3725万吨，仅占4.6%；,2023年我国生鲜牛乳产量3755万吨，比2023年增加0.8%；奶制品加工量2761.1万吨，比2023增长4.1%；,市场状况：,洋牛奶、洋奶粉疯狂冲击了国内市场，危及养牛业,疫情防控未做好，如布氏病有上升趋势,消费者对国产奶缺乏信念，行业信任危机照旧存在,企业诚信欠失：改生产日期，乳品使用防腐剂,乳源质量安全仍旧让人放心不下,我国奶业存在的问题,二、乳品主要危害因素,兽药残留,霉菌毒素,非法添加,农药残留,微生物,兽药残留是指动物产品的任何可食局部所含兽药的母体化合物及其代谢物，以及与兽药有关的杂质。,兽药残留,127种兽药残留最大残留限量种类数量比较,奶牛饲养过程中由于不合理使用治疗药物和饲料药物添加剂，导致牛奶中广泛存在兽药残留。兽药残留对人体安康有较大危害作用，主要表现为过敏反响、细菌耐药性、致畸致癌作用，以及激素作用等方面。,兽药残留的危害,化合物,动物,/,组织,推荐检测方法,检测限,(,或定量限,),(g/L,）,残留限量,MRL,（,g/kg,）,-,内酰胺类,牛,/,奶,动物性食品中,-,内酰胺类药物多残留检测 超高效液相色谱,-,串联质谱法,青霉素,G,：,1,4,阿莫西林、氨苄西林：,1,10,苯唑西林：,1,30,氯唑西林：,1,30,头孢喹肟：,1,20,头孢氨苄：,1,100,阿维菌素类,牛,/,奶,高效液相色谱法,HPLC,（,GB 29696-2013,）,阿维菌素、多拉菌素：,1,ND,伊维菌素：,1,10,地塞米松,牛,/,奶,液相色谱质谱法,LC-MS-MS,（,1031,号公告,-2-2008,）,地塞米松,e0.2,（,定量限）,0.3,氟喹诺酮类,牛,/,奶,液相色谱质谱法,LC-MS-MS,（,GB/T 21312-2007),高效液相色谱法,HPLC,（,GB 29692-2013,）,环丙沙星、恩诺沙星：,25,100,达氟沙星：,7.5,30,氟甲喹：,12.5,50,洛美沙星、氧氟沙星：,0.5,ND,诺氟沙星、培氟沙星,1.0,磺胺类,牛,/,奶,液相色谱质谱法,LC-MS-MS,（,781,号公告,-12-2006,）,磺胺（二）甲基嘧啶,2.0,100,磺胺二甲异嘧啶,1.0,磺胺甲氧嘧啶,3.0,磺胺甲基异噁唑,4.0,磺胺异噁唑,5.0,甲砜霉素,牛,/,奶,高效液相色谱法,HPLC,（,GB 29689-2013,）,甲砜霉素,10,50,林可胺类和,大环内酯类,牛,/,奶,动物性食品中林可胺类和大环内酯类药物多残留检测超高效液相色谱,-,串联质谱法,1,150,四环素类,牛,/,奶,牛奶中四环素类药物残留检测超高效液相色谱,-,串联质谱法,四环素、土霉素、金霉素,5,100,多西环素,5,ND,2023年动物及动物产品兽药残留监控打算,霉菌毒素是丝状真菌或霉菌在生长生殖过程中通过不同的代谢途径产生的代谢物，如多聚乙酰途径黄曲霉毒素、氨基酸途径黄曲霉毒素等；,目前已觉察了300多种的霉菌毒素，其中黄曲霉毒素、赭曲霉素、伏马菌素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇等倍受关注。,乳品中最受关注的霉菌毒素是黄曲霉M1；奶牛摄入被黄曲霉毒素B1污染的饲料后，通过羟基化作用转化成黄曲霉毒素M1。,黄曲霉毒素M1危害主要表现在致癌性和致突变性，对人及动物肝脏组织有破坏作用，可导致肝癌甚至死亡。,霉菌毒素,非法添加添加物：,三聚氰胺,、,-,内酰胺酶,、碱性物质、皮革水解蛋白等,B.,超标超限添加物：,增稠剂、防腐剂、抗氧化剂等，其他未允许用的食品添加剂,非法添加或超标超限添加物,农药残留是指任何由于使用农药而在食品、农产品和动物饲料中消失的特定物质。分为杀虫剂包括杀螨剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调整剂、杀鼠剂等。,农药残留,中国牛奶中农药限量共涉及10种农药艾氏剂和狄氏剂、氯丹、滴滴涕、硫丹、倍硫磷、六六六、七氯、林丹、马拉硫磷、甲胺磷，其中GB 2763-2023及其第一号修改单中限定7种，无公害食品生鲜牛奶NY5045-2023限定种。,微生物,牛含有肯定数量的微生物，主要来源于两方面：一是患病乳牛对生鲜乳的污染，二是挤奶过程中的污染，三是挤奶后运输途中受到的污染或原有微生物的增殖。,牛奶中的微生物主要有细菌乳酸菌、丙酸菌、肠细菌、孢子杆菌等、真菌霉菌有乳粉胞霉、乳酪粉胞霉、黑念珠霉、变异念珠霉、乳酪青霉、灰绿青霉和黑曲霉等和噬菌体侵害细菌的滤过性病毒统称为噬菌体，亦称为细菌病毒。目前已觉察大肠杆菌、乳酸菌、赤痢菌、沙门氏杆菌、霍乱菌、葡萄球菌、结核菌、放线菌等。,乳品主要危害因素的检测方法,气相色谱法GC,高效液相色谱法HPLC,超高效液相色谱法UPLC,气谱-质谱法GC-MS,气谱-串联质谱法GC-MS/MS,液谱-质谱法LC-MS,液谱-串联质谱法LC-MS/MS,其他新技术，如飞行时间质谱等,胶体金免疫层析法,荧光免疫层析检测法,酶联免疫吸附测定法,化学发光免疫检测法,放射免疫测定法,荧光偏振免疫检测法,微生物抑制测定法,生物传感器,生物芯片,主要有色谱分析技术和快速检测技术,方法名称,优点,缺点,适用范围,液相色谱-质谱仪等仪器,灵敏、准确，可靠性好,检测费用高、操作繁琐耗时、人员要求很高,省部级以上检测机构及有条件的食品进出口企业,酶联免疫试剂盒,灵敏、快速、成本低，可大批量同时检测，既能定性也能定量，一般检测时间,1-2h,对检测人员要求较高,市县级以上检测机构及一定规模的食品生产加工企业,免疫层析检测,灵敏、快速、成本低，可现场大批量筛查，样品无需或仅需简单前处理，检测时间,3,-,10,min,，判定快速简单，对场所和人员无要求,有假阳性和假阴性的可能,乡镇级以上检测机构及食品生产加工流通企业,仪器确证方法和快速检测方法比较,三、免疫层析检测技术,免疫层析技术LFIA的进展,第一代免疫层析：胶体金技术,其次代免疫层析：荧光素标记免疫层析技术,第三代免疫层析：量子点标记技术(QD),时间区分免疫荧光技术(TRFIA),上转发光技术(UPT),1,、胶体金免疫层析技术,样品垫：具有过滤和缓冲作用，降低样本离子强度或酸碱度对检测结果的干扰；,金标垫：将胶体金标记Ab固定在金标垫上，目标物首先在此与金标Ab的反响；,NC膜：预先包被检测线T线和质控线C线，与胶体金标记物通过免疫反响相结合，使胶体金颗粒在检测线发生聚拢。,吸水垫：通过层析作用使样品、金垫上的金标Ab移动。,胶体检测试纸条的构造与作用,原理图示小分子抗原为例,分类：夹心法、竞争法直接竞争法和间接竞争法,1双抗体夹心法,抗体1：检测线T线位置；,金标抗体2：金标垫上；,样本中的抗原先与金标抗体2结合，形成的“抗原+金标抗体2”再与T线位置的抗体1结合，从而金标抗体复合物在T线处聚拢显色。,用于大分子抗原的检测,T,线的显色强度与目标物的浓度呈正相关,2直接竞争法免疫层析,T,线的显色强度与目标物的浓度呈负相关,抗体：检测线T线；,金标抗原：金标垫；,样本中的抗原与释放垫上的金标抗原竞争，与T线上的抗体结合；,样品中目标物的含量越高则T线处结合聚拢的金标抗原越少，显色越弱。,3间接竞争法免疫层析,T,线的显色强度与目标物的浓度呈负相关,抗原：检测线T线；,金标抗体：金标垫；,样本中的抗原与金标抗体结合，形成的“Ag+金标Ab”复合物；,游离的金标抗体与T线上的抗原结合，从而金标抗体在T线处聚拢显色。,产品形式与,检测步骤,检测卡,试纸条,取适量液体乳品样本加到检测卡加样孔中；,3-10min后，通过T和C线显色状况进展阴阳性判定,将试纸条插入含有适量乳品样本的微孔中；,3-10min后，通过T和C线显色状况进展阴阳性判定,金标微孔,+,试纸条,取适量液体乳品与微孔中的金标抗体混合，反响3-5min；,将试纸条插入金标微孔，3-10min后，通过T和C线显色状况进展阴阳性判定,结果判定方法,阳性:T线与,C,线都显色；,阴性:C线显色,T线不显色；,无效:C线不显色，结果判定为无效。,A夹心法胶体金免疫层析,阴性 阳性 无效,B竞争法胶体金免疫层析,阴性:T线与C线都显色，说明样品中目标物含量低于检测限；,阳性:C线显色,T线不显色，说明样品中目标物的浓度高于检测限；,无效:C线不显色，结果判定为无效。,优势,不足之处,快速：,全部检测过程大概,3-10min,简便,：不需要复杂的仪器设备，也无需专业人员操作，可进行现场检测,廉价,：价格低，支持单样本检测,稳定,：金标试剂稳定性好，可长期保存,适用性范围广,：可应用于多种类型样本的检测,前处理简单,：对于某些液体样本，无需样本前处理，直接检测,定量问题,灵敏度问题,胶体金免疫层析的优缺点,荧光免疫层析技术Fluorescence immunoassay,以荧光物质为标记物；,将抗原抗体反响的特异性与荧光技术的敏感性相结合；,荧光物分子在特定条件下吸取激发光的能量后，呈激发态而极不稳定，在其快速回到基态时，以电磁辐射形式释放出光能，放射出波长比激发光波长长或短的荧光，从而通过荧光检测仪器进展检测。,2,、荧光免疫层析技术,性能指标,胶体金检测卡,荧光定量检测卡,灵敏度,相对较高,判读方式,肉眼判读,仪器判读,结果判读,一致性,不同人判读结果稍有差异,结果判读不依赖于人,结果显示形式,阴性或阳性,定量数值,样本测试范围,只能判读阴性、,1/2,检测限、检测限的结果,能判读定量范围内任意浓度样本的定量值,自带定量曲线,直接加样即可读出定量结果,数据保存,人工输入判读结果做记录保存,软件记录仪器测试过的所有样本数据并自动保存，后台数据中心远程监控,与胶体金免疫层析技术比较分析,与ELISA检测方法比较,兼具胶体金检测卡和 ELISA 的优点，避开了大量的分别和洗涤步骤，适宜进展高通量和定量检测，并且同样具有简便、快捷、低廉等优点。,与UPLC-MS-MS的比较,维德维康荧光定量检测卡产品乳品,一般荧光免疫层析,间接竞争法：,在免疫层析过程中，有机荧光染料或荧光微球标记的抗体，与样品中的目标物结合形成Ag+荧光标记Ab复合物；,之后，游离的荧光标记抗体与T线位置上包被的抗原结合，从而荧光物质在T线聚拢；,在激发光的作用下，荧光物质放射荧光，荧光信号的强弱目标物的含量相关。由此，依据荧光信号的强弱可实现对样本中目标物的定量检测。,常用的有机染料：,罗丹明,FITC(异硫氰酸荧光素),花青染料 (如：cy3 和cy5),DAPI4,6-二脒基-2-苯基吲哚,量子点荧光免疫层析,量子点(Quantum dots,QDs)，是一种由-族如 CdTe、CdSe、ZnS 或-族如 InAs、InP 等组成的纳米颗粒。,较于传统的有机染料，其具有激发光谱宽、放射光谱窄且重叠小等优点；,单一光源激发，不同量子点所发出荧光不同，故可进展多组分检测。,量子点的荧光强度可比一般荧光染料高100 倍左右，灵敏度，且稳定性较好；,具有良好的生物兼容性，可与抗体、核酸等生物分子进展特异性的连接。,量子点CdSe和罗丹明6G染料激发光/放射光的比较,相比于罗丹明6G染料：,量子点的激发光绿色短划线波长范围较宽,量子点的放射光绿线根本上是对称的，且波长范围更窄。,时间区分荧光免疫层析,将镧系元素螯合物或微球用作抗体或抗原荧光标记物；如铕(Eu)、钐Sm)、镝(Dy)、锝(Te),镧系元素的荧光光谱有较大的Stokes位移，最大可达290nm；,激发光谱和放射光谱间不相互重叠；,放射光谱很窄，荧光寿命长；,上转发光免疫层析,利用UCP颗粒稀土离子作为荧光材料，通过连续吸取较低能量的长波红外光,放射高能量的