常用实验基本技术细胞培养-课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,常用实验基本技术（续）,常用实验基本技术（续）,四大常用基本技术,逆转录,-,聚合酶链反应（,RT-PCR,）,免疫组织化学技术（免疫组化）,免疫印迹技术（,Western blot,）,细胞培养技术,局限性 联合应用,四大常用基本技术逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）局限性,细胞培养技术,细胞培养（,Cell culture,）是指从生物体内取出组织或细胞，在体外适当的条件下，使之存活、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。,细胞培养便于应用各种方法和技术进行研究，并可直接观察，已成为现代生物医学研究中一项非常重要的技术。,细胞培养技术细胞培养（Cell culture）是指从生物体,培养细胞的生存条件,无菌环境（器皿、超净台）,超纯水,温度（,37,左右,）,气体（,5%CO,2,/,空气）,PH,值（,7.0-7.4,，细胞耐酸不耐碱）,营养条件（基础培养基,+10%FBS,）,渗透压、培养基质等,培养细胞的生存条件无菌环境（器皿、超净台）,细胞培养用液,平衡盐溶液：洗涤组织、细胞,D-Hanks,液、,PBS,液等。,消化液：分散细胞,0.25%,胰酶、,0.02%EDTA,液或二者混合使用,培养液：细胞生存、生长和繁殖,基础培养基,(,DMEM,、,RPMI1640,等,），已商品化,10%,左右的胎牛血清（,FBS,）,细胞培养用液平衡盐溶液：洗涤组织、细胞,培养细胞的来源,直接取材：,实验动物、胚胎、临床标本等,细胞系：,各实验室保存,细胞库：,上海中科院细胞库、武汉细胞库、,中国医科院细胞中心,培养细胞的来源直接取材：,培养方式,原代培养：,直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养。,只能原代培养：神经元、心肌细胞等。,传代培养：,当培养细胞增殖到一定密度后，生长受到抑制，,需要分散稀释后重新培养。,常见：肿瘤细胞系,培养方式原代培养：,培养细胞的处理,改变细胞外部因素,改变细胞内部因素,培养细胞的处理改变细胞外部因素,外部因素,药物,高温,低氧,射线,外部因素药物,内部因素,改变细胞内基因表达水平：,上调：基因转染,下调：,RNAi,内部因素改变细胞内基因表达水平：,细胞转染,转染（,transfection,）是指将外源性,DNA,或,RNA,导入细胞的过程。,上调目的基因表达：,质粒载体,病毒载体,下调目的基因表达：,化学合成,siRNA,质粒载体,病毒载体,细胞转染转染（transfection）是指将外源性DNA或,转染方法,电转法,脂质体介导的转染法,病毒载体介导的转染法,转染方法电转法,转染试剂,脂质体与非脂质体：商品化，多家公司如,Invitrogen,、,Fermentas,、,Qiagen,等都有售。,常用：,Invitrogen,公司,Lipofectamine 2000,可用来转染质粒和,siRNA.,其他专用试剂：如,Invitrogen,公司,RNAiMAX Transfection Reagent,专门用来转染,siRNA.,转染试剂脂质体与非脂质体：商品化，多家公司如Invitrog,瞬时转染与稳定转染,瞬时转染,：将,DNA,导入活细胞内，但,DNA,不会嵌入细胞的染色体中，可在,2-3,天内收集被转染的细胞进行基因表达分析。,稳定转染,：将目的基因导入活细胞，根据选择标记经过一段时间的筛选，使目的基因整合入细胞染色体中，从而得到稳定表达目的基因的细胞系。,瞬时转染与稳定转染瞬时转染：将DNA导入活细胞内，但DNA不,真核筛选标记,真核筛选标记,设立对照组,空载体对照：如,PCDNA3,、,PEGFP-N1,等。,Scrambled siRNA,：将选中的,siRNA,序列打乱。作为阴性对照的,scrambled siRNA,应该与选中的,siRNA,序列有相同的核苷酸组成，并且与目的基因的,mRNA,没有明显的同源性。,设立对照组空载体对照：如PCDNA3、PEGFP-N1等。,细胞特性检测,活力：,MTT,实验,凋亡：,TUNEL,染色、流式细胞术等,增殖：,BrdU,掺入法、克隆形成实验,分化：形态学观察、分化标志物检测,致瘤性：体内成瘤实验,细胞特性检测活力：MTT实验,靶基因表达水平检测,RT-PCR,Western blot,免疫组化,其他：基因芯片、流式细胞术等,靶基因表达水平检测RT-PCR,细胞培养的应用,用途：,1.,验证体内实验结果,2.,进行深入机制研究,优点：可同时获得大量生物学性质相似的细胞作为研究对象，便于施加各种干预因素，方便观察与检测。,局限性：不能准确反应体内的真实状况，需与体内实验相互验证。,细胞培养的应用用途：,神经干细胞分离培养,取,E12.5d,小鼠胚胎端脑，制成单细胞悬液，接种于神经干细胞培养基，体外培养,2,天，可见神经球形成。,神经干细胞分离培养取E12.5d小鼠胚胎端脑，制成单细胞悬液,NSC,鉴定,体外培养神经干细胞,BrdU(+),，,Nestin(+),，并能分化为,MAP2(+),神经元和,GFAP(+),星形胶质细胞。,NSC鉴定体外培养神经干细胞BrdU(+)，Nestin(+,出生后,7,天小鼠脑切片，可见,G-CSFR,与,Nestin,共表达。,SVZ,：室管膜下区；,LV,：侧脑室,体外培养神经干细胞，免疫染色结果显示：,Nestin,（神经干细胞,marker,）与,G-CSFR,共表达于神经干细胞。,RT-PCR,结果也显示神经干细胞表达,G-CSFR,。,出生后7天小鼠脑切片，可见G-CSFR与Nestin共表达。,体外培养神经干细胞，免疫染色结果显示：与对照组相比，,G-CSF,作用组,BrdU,阳性细胞比例明显增高。,体外培养神经干细胞，免疫染色结果显示：与对照组相比，G-CS,小鼠脑切片，免疫染色结果显示，与对照组（,CT,）及缺血缺氧性模型组（,HI,）相比，,G-CSF,处理组（,HI+G-CSF,）室管膜下区（,SVZ,）,BrdU,阳性细胞数明显增加。,小鼠脑切片，免疫染色结果显示，与对照组（CT）及缺血缺氧性模,谢谢！,谢谢！,