重组体克隆的筛选和鉴定

,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六章,重组体克隆的筛选和鉴定,17,大肠杆菌,一、抗药性标记及其插入失活选择法,pBR322,质粒上有两个抗菌素抗性基因,:,Tet,r,和,Amp,r,。,Tet,r,上有插入位点,BamH I,和,Sal I;,Amp,r,上有插入位点,Pst I,。,第一节,载体表型选择法,1.,原理：,pBR322,（,1,）四环素：,（,2,）氨苄青霉素抗性基因：,2.pBR322,抗菌素标记选择,产生,-,内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘,-,青霉素指示液（,I,2,-KI-Aampicillin,）（蓝灰色）褪色。,抑制细菌生长，但不杀死细菌。,杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,（,3,）环丝氨酸：,3.,选择过程：,如果在,Tet,r,上插入外源,DNA,，导致四环素抗性基因失活，可用,四环素加环丝氨酸,平板培养基选择重组克隆。,Tet,r,失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；,Tet,r,不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,（,1,）四环素抗性插入失活,无环丝氨酸培养基,（,2,）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,如果,Amp,r,上插入外源,DNA,，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘,-,青霉素指示液选择。,二、,-,半乳糖苷酶显色反应选择法,-,半乳糖苷酶,乳糖,半乳糖,葡萄糖,Xgal,半乳糖,5-,溴,-4-,氯靛蓝,+,+,深蓝色,1.,原理：,载体,上有一段,-,半乳糖苷酶基因（,Lac Z,）的,片段（氨基端），其上有外源,DNA,的插入位点。,受体菌基因组,中有突变的,-,半乳糖苷酶基因（,片段缺失）。可以被,IPTG,诱导表达。载体和受体菌基因组可以,互补,形成完整有功能的,-,半乳糖苷酶。,Xgal-(5-,溴,-4-,氢,-,吲哚,半乳糖苷,),-,半乳糖苷酶法,lacZ,Am,N,2,H,片段,COOH,片段,X-gal,Lac Z,蓝色化合物,X-gal,（,LacZ,基因,N,端序列）,插入片段,（,LacZ,基因失活）,LacZ,基因,N,端序列,LacZ,酶,2.,选择过程,-,半乳糖苷酶使,Xgal,分解成兰色产物。,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,一、直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,第二节,DNA,电泳检测法,分子量,Marker,载体,重组克隆,筛选过程,1.,原理,PCR,能在模板序列上扩增出预期,DNA,片断。,2.,过程,（,1,）从重组克隆中提取质粒（或,DNA,）。,（,2,）按照外源,DNA,插入片断设计引物作,PCR,。,（,3,）电泳,PCR,产物。,（,4,）检查是否有,PCR,产物。,（,5,）,PCR,产物的长度是否与外源基因一致。,第三节,PCR,扩增检测法,凝胶电泳检测,加样孔,DNA Marker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的,PCR,扩增片段,电泳检测法、酶切法、法凝胶电泳检测,1.,核酸,杂交,第四节,核酸杂交检测法,一、原理：,重组克隆与探针杂交。,3.,识别标记,32,P,或,125,I,。,（,1,）放射性同位素,2.,检测用的探针,与外源,DNA,插入片断互补的序列。,（,2,）非放射性标记,荧光素,二、核酸杂交检测方法,用,DNA,（或,RNA,）探针检测,DNA,样品。,1.Southern blotting,从宿主细胞中提取,DNA,（或质粒载体），再用探针杂交。,只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。,（,1,）原位杂交筛选,特点：,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,利用抗体作为,“,探针,”,来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：,一、放射性抗体检测法,第五节,免疫化学检测法,1.,抗体与产物的结合方式,对表达产物的检测。,蛋白,蛋白,“,杂交,”,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,125,I,标记的二,抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因,产物蛋白,一抗,125,I,标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因,产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,125,I,标记的二抗,结合蛋白,125,I,标记的二抗,2.,放射性抗体检测法过程,二、免疫沉淀检测法,把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成,“,沉淀圈,”,。,1.,原理,抗原,抗体凝集反应。,检测分泌型产物。,2.,方法,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,三、酶联免疫吸附测定（,ELISA,）,E,nzyme-,l,inked,i,mmuno,s,orbant,a,ssay,1.,原理：,一抗（,primary antibody,）,:,与目标分子的特异结合。,二抗（,secondary antibody,）：,与一抗的特异性结合。,酶连（,enzyme-linke,）,：,二抗上携带一种酶,能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,19,2.ELISA,检测的一般步骤,（,1,）固定样品,将待测样品加入,96,孔微量滴定板（,microtiter plate,）的孔中，干燥后就被固定在,孔底,。,孔底,加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。,（,2,）一抗结合,一抗,加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。,二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。,（,3,）二抗结合,二抗,加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。,（,4,）显色反应,在特殊的分光光度仪（,酶标仪,）上比色，打印出结果。,（,5,）比色,3.ELISA,的局限性,有效，但准确性稍差（,主要取决于一抗的特异性,）。,必须与其他方法一起综合考虑。,最好用单克隆抗体（,monoclonal antibody,）,临床检验常用的单抗,结果,多克隆抗体,Blotting,的结果,单抗,blotting,结果,一般克隆与筛选策略,